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油茶蒲抑制良性前列腺增生活性成分的分离纯化及其作用研究

作　者: 郑茜茜
导　师: 沈建福
学　校: 浙江大学
专　业: 食品工程
关键词: 油茶蒲 5α-还原酶 前列腺增生 分离纯化 BPH-1细胞
分类号: R697.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


良性前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia,BPH)是常见的老年男性病,大约有80%老年男性的生活质量因此受到严重影响,5α-还原酶对BPH的形成起着重要作用。本文以5α-还原酶的抑制率为指标,研究确定了油茶蒲中抑制5α-还原酶活性成分的分离纯化方法,采用细胞模型和动物实验探究了活性成分对BPH的作用,为开发高效低毒的BPH治疗药物提供理论依据。主要的研究内容和结果如下：(1)优化5α-还原酶活性的紫外分光光度检测法,以睾酮(T)替代传统的NADPH作为检测对象,测定方法为：2mL测活体系中T20μmol/L,NADPH40μmol/L,酶提取物260μg,37℃测定4min内248nm处的吸光度值。该法检测结果与高效液相色谱法(HPLC)相当。(2)建立油茶蒲活性成分的提取、纯化、精制及制备方法：ⅰ)活性成分的提取：选择50%7,醇(v/v)作为提取溶剂,该醇提物对5a-还原酶的抑制率为36.31%4±2.76%,得率11.96%。ⅱ)活性成分的纯化：选择AB-840%乙醇洗脱相(OCE)作大孔树脂柱层析条件,OCE对5a-还原酶抑制率为57.79%±1.67%,得率26.5%。ⅲ)活性成分的精制：以正丁醇-甲醇-水-冰醋酸(3：2：2：1)为展开剂,0.5%(w/v)FeCl3乙醇溶液为显色剂,应用聚酰胺色谱法代替硅胶色谱法得到分离度良好的Fr1-Fr7流份(见P37图3.1),Rf为0.85～0.0375,其中Fr6、Fr5、Fr4对5α-还原酶的抑制率分别为85.38%±3.71%、76.28%±1.37%、73.01%±2.93%,较纯化前OCE的抑制率显著增加(p<0.01),得率分别为3.79%、2.10%、0.64%。明确了油茶蒲的特征酚类物质没食子酸、鞣花酸及MEAG不是抑制5α-还原酶活性的关键化合物。ⅳ)关键化合物的制备：采用半制备HPLC分离Fr5得到活性单体F0和F0’,对5α-还原酶的抑制率分别为76.47%4±0.02%和92.08%±0.18%,对应得率为5.17%和1.19%,由LC-MS推测出F0和F0’的分子量分别为449和335。(3)采用MTT法和Annexin V/PI双染色法测定油茶蒲活性成分抑制人良性前列腺增生细胞BPH-1增殖和诱导细胞凋亡作用。在浓度为50μg/mL时,抑制增殖作用的强弱顺序为Fr6>非那雄胺>Fr5≈F0>Fr4≈Fr3>OCE>Fr2,其中Fr6抑制活性最高(抑制率50.0%±0.7%),Fr5和FO次之(抑制率分别为43.7%±2.1%和41.4%±2.1%),且抑制作用呈时间-剂量依赖性。F0诱导细胞凋亡作用呈剂量依赖性,Fr6在浓度为25μg/mL时诱导的细胞凋亡率为12.1%±3.8%,与非那雄胺的效果相近,极具研究和开发价值。(4)油茶蒲活性成分对BPH-1细胞增殖的抑制作用,与其对5α-还原酶活性的抑制作用结果一致,证实了油茶蒲活性成分作为5α-还原酶抑制剂对改善前列腺增生的有效性。(5)油茶蒲醇提物能有效改善丙酸睾酮致大鼠前列腺增生症状,显著降低大鼠前列腺和腹叶指数(p<0.05),改变增生组织病理学形态,抑制大鼠前列腺内5α-还原酶和酸性磷酸酶的活性(p<0.01),并提高大鼠体内的抗氧化水平。综上所述,油茶蒲活性成分可通过降低5a-还原酶活性、抑制前列腺细胞增殖、诱导细胞凋亡、清除自由基等多个靶点的作用,有效预防并治疗BPH。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
縮略词表  9-13
第一章 绪论  13-31
  1.1 5α-还原酶  13-17
    1.1.1 5α-还原酶的概述  13-14
    1.1.2 5α-还原酶活性的测定方法  14-17
  1.2 前列腺增生  17-20
    1.2.1 前列腺增生的临床症状与患病率  17-18
    1.2.2 前列腺增生的发病机制及与5α-还原酶的关系  18-19
    1.2.3 5α-还原酶抑制剂  19-20
  1.3 植物药  20-26
    1.3.1 国内外植物药研究现状  20-22
    1.3.2 天然产物中5α-还原酶抑制活性成分的分离纯化  22-23
    1.3.3 植物药机理研究  23-26
  1.4 油茶蒲简介  26-29
    1.4.1 油茶产业概况  26-27
    1.4.2 油茶蒲的生物活性  27-29
  1.5 本文研究的依据、意义和主要内容  29-31
    1.5.1 研究依据  29
    1.5.2 研究目的及意义  29
    1.5.3 研究的主要内容  29-30
    1.5.4 研究的创新点  30-31
第二章 5α-还原酶活性测定方法的优化与比较  31-41
  2.1 引言  31
  2.2 材料试剂和仪器  31-32
    2.2.1 材料试剂  31
    2.2.2 实验仪器  31-32
    2.2.3 试剂的配制  32
  2.3 实验方法  32-35
    2.3.1 大鼠5α-还原酶的制备  32
    2.3.2 蛋白质含量的测定  32
    2.3.3 睾酮紫外光谱扫描  32-33
    2.3.4 睾酮标准曲线测定  33
    2.3.5 5α-还原酶活性紫外分光光测定法的优化  33-34
    2.3.6 HPLC法测定5α-还原酶抑制活性  34-35
    2.3.7 紫外分光光度法与HPLC法测定5α-还原酶活性的比较  35
    2.3.8 统计学分析  35
  2.4 实验结果  35-40
    2.4.1 睾酮浓度的确定  35-36
    2.4.2 NADPH浓度的确定  36
    2.4.3 5α-还原酶提取物用量的确定  36-37
    2.4.4 5α-还原酶反应体系的稳定性  37
    2.4.5 非那雄胺对5α-还原酶的抑制活性  37-38
    2.4.6 HPLC法测定5α-还原酶抑制活性  38
    2.4.7 三种5α-还原酶活性测定方法的比较  38-40
  2.5 本章结论  40-41
第三章 油茶蒲中抑制5α-还原酶活性成分的分离纯化  41-63
  3.1 引言  41
  3.2 材料试剂和仪器  41-42
    3.2.1 材料试剂  41-42
    3.2.2 仪器  42
  3.3 实验方法  42-46
    3.3.1 活性成分的提取  42-43
    3.3.2 活性成分的纯化  43
    3.3.3 活性成分的精制  43-44
    3.3.4 关键化合物的制备  44-45
    3.3.5 HPLC检测  45
    3.3.6 5α-还原酶抑制活性测定  45
    3.3.7 主要化学成分的测定  45-46
    3.3.8 统计学分析  46
  3.4 实验结果  46-62
    3.4.1 溶剂提取方法的确定  46-47
    3.4.2 大孔树脂纯化方法的确定  47-48
    3.4.3 聚酰胺精制方法的确定  48-49
    3.4.4 HPLC检测结果  49-51
    3.4.5 Frl-Fr7的5a-还原酶抑制活性  51-52
    3.4.6 主要化学成分的测定  52-56
    3.4.7 5α-还原酶抑制活性与皂苷、总酚、黄酮含量的相关性  56-57
    3.4.8 Fr5半制备HPLC分离单体  57-58
    3.4.9 液质联用(LC-MS)分析  58-60
    3.4.10 讨论  60-62
  3.5 本章结论  62-63
第四章 油茶蒲活性成分对人前列腺增生细胞BPH-1的作用  63-74
  4.1 引言  63
  4.2 材料和仪器  63-64
    4.2.1 材料  63
    4.2.2 仪器  63-64
    4.2.3 试剂的配制  64
  4.3 实验方法  64-65
    4.3.1 BPH-1细胞的培养  64
    4.3.2 MTT法测定细胞增殖  64-65
    4.3.3 Annexin V/PI双染色法测定细胞凋亡  65
    4.3.4 统计学分析  65
  4.4 实验结果及讨论  65-72
    4.4.1 油茶蒲活性成分对BPH-1细胞增殖的作用  65-68
    4.4.2 油茶蒲活性成分对BPH-1细胞形态的影响  68-69
    4.4.3 油茶蒲活性成分对BPH-1细胞凋亡的作用  69-71
    4.4.4 讨论  71-72
  4.5 本章结论  72-74
第五章 油茶蒲醇提物对大鼠前列腺增生的作用  74-81
  5.1 引言  74
  5.2 材料和仪器  74-75
    5.2.1 材料  74
    5.2.2 仪器  74-75
    5.2.3 试剂的配制  75
  5.3 实验方法  75-76
    5.3.1 动物处理及分组  75
    5.3.2 检测指标  75-76
  5.4 实验结果  76-80
    5.4.1 前列腺指数  76-77
    5.4.2 病理切片检查  77-79
    5.4.3 大鼠前列腺5α-还原酶的活性  79
    5.4.4 大鼠血清中前列腺酸性磷酸酶(PAP)活性  79
    5.4.5 油茶蒲醇提物对大鼠体内抗氧化水平的影响  79-80
  5.5 本章结论  80-81
第六章 结论与展望  81-84
  6.1 结论  81-82
  6.2 展望  82-84
致谢  84-85
参考文献  85-91
附录  91-92
作者简介  92

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 泌尿科学（泌尿生殖系疾病） > 男性生殖器疾病 > 前列腺疾病 > 前列腺肥大
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