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大黄素抗乳腺癌作用与ERα信号通路之间的关系及免疫调节的研究

作　者: 王丽梦
导　师: 谢明杰
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 大黄素乳腺癌雌激素受体α 信号通路免疫调节
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

乳腺癌是一种雌激素依赖型肿瘤，许多证据表明，雌激素（Estradiol,E2）刺激是乳腺癌发生的一个重要致病因子，其生物学活性受雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）的调节。ERα通过介导基因组信号通路和非基因组信号通路发挥雌激素促增殖和抗凋亡作用，该信号通路的异常活化是乳腺癌发病的首要原因。目前，以他莫西芬为代表的选择性雌激素受体调节剂（selective estrogen receptor modulator，SERM）是最具代表性的抗雌激素类药物，其作用机制主要靶向干预ERα信号通路。但随着治疗的深入，患者身上出现了不同程度的耐药性问题，并且多数对机体免疫功能起抑制和破坏等副作用。因此，寻找毒副作用小、安全有效的抗肿瘤药物成为近些年各国学者的研究热点。近年来，天然产物因具有明显的抗肿瘤活性及毒副作用小的特性而受到人们的高度关注。天然蒽醌类化合物广泛存在于自然界中，具有多种药理学功效，可通过不同机制发挥抗肿瘤作用。目前临床上常用的抗肿瘤药物阿霉素及米托蒽醌的基本母核亦是蒽醌结构，提示具有蒽醌类母核结构的化合物具有抗肿瘤活性。大黄素是从中药材大黄、虎杖、芦荟等分离得到的一种有较强抗肿瘤活性的天然蒽醌类化合物，其抗肿瘤和免疫调节作用是目前人们研究的热点。由于目前对大黄素抗乳腺癌作用及其信号机制还缺乏深入研究，关于大黄素抗乳腺癌作用与ERα信号通路的关系，国内外鲜见相关报道，故本实验对大黄素体外抗乳腺癌作用与ERα信号通路之间的关系进行了系统的研究，并检测了大黄素对机体免疫的调节作用，旨在为研发和应用新型抗乳腺癌药物提供一定的理论依据。研究结果如下1、采用MTT比色法，检测大黄素体外对人乳腺癌细胞增殖的影响。结果显示，大黄素对ERα阳性MCF-7细胞和ERα阴性MDA-MB-231细胞的增殖均有抑制作用，但是对ERα阳性MCF-7细胞增殖的抑制作用更显著，呈明显的剂量和时间依赖关系。2、采用MTT比色法和流式细胞仪分析，检测大黄素对E2促细胞增殖和抗细胞凋亡作用的影响。结果显示，E2能够显著促进MCF-7细胞的体外增殖并抑制细胞凋亡，而大黄素能有效抑制E2诱导的MCF-7细胞增殖和抗凋亡作用，将E2诱导的MCF-7细胞周期阻滞在G0/G1期。3、采用Western blotting方法和荧光素酶报告基因分析，检测大黄素对MCF-7细胞中的雌激素受体α蛋白表达及其转录活性的影响。结果显示，大黄素对ERα蛋白表达及其转录活性有显著的抑制作用，呈剂量依赖性。4、采用Western blotting方法，检测大黄素对ERα靶基因蛋白CyclinD1和Bcl-2表达的影响。结果显示，大黄素对MCF-7细胞中ERα靶基因蛋白Cyclin D1和Bcl-2表达均有显著抑制作用。5、采用Western blotting方法，检测大黄素对E2快速诱导MCF-7细胞的MAPK/Erk1/2信号通路和PI3K/Akt信号通路的影响。结果显示，大黄素能抑制E2诱导的Akt和MAPK蛋白的磷酸化，但是对Akt蛋白活性的抑制作用更显著。说明大黄素干预ERα非基因组信号通路的作用主要通过PI3K/Akt信号通路来实现。6、采用吞噬中性红法和MTT比色法，检测大黄素对非特异性免疫细胞的影响。结果显示，大黄素可提高小鼠腹腔巨噬细胞的代谢活力及吞噬能力，呈剂量依赖关系。同时，大黄素可显著提高NK细胞的活性，随着药物浓度的增加，NK细胞的活性逐渐增强，说明大黄素对非特异性免疫细胞具有促进作用。7、采用MTT比色法，检测大黄素对特异性免疫细胞的影响。结果显示，大黄素对小鼠脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖无明显促进作用。8、采用体外溶血实验，检测大黄素对人红细胞的影响。结果显示，大黄素各浓度组无溶血现象发生及红细胞凝集现象，溶血率＜5%，说明大黄素是一种安全无毒性的天然产物。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
1 引言  10-23
  1.1 ERα信号通路与乳腺癌的关系  10-15
    1.1.1 ERα信号通路简介  10-12
    1.1.2 ERα基因组途径  12-13
    1.1.3 ERα非基因组途径  13-15
  1.2 乳腺癌抗雌激素治疗的研究现状  15-16
  1.3 乳腺癌免疫生物治疗的研究进展  16-17
  1.4 天然产物大黄素作为抗肿瘤药物的潜在价值  17-22
    1.4.1 天然产物大黄素的结构  18
    1.4.2 大黄素的抗肿瘤作用机制  18-22
  1.5 本文研究内容  22-23
2 大黄素抗乳腺癌作用与 ERα信号通路之间的关系  23-39
  2.1 实验材料  23-25
    2.1.1 材料和试剂  23
    2.1.2 主要仪器  23-25
  2.2 实验方法  25-30
    2.2.1 主要试剂配制  25-26
    2.2.2 细胞培养  26
    2.2.3 MTT 比色法检测细胞活力  26
    2.2.4 流式细胞术分析检测细胞周期分布与细胞凋亡  26-27
    2.2.5 荧光素酶报告基因分析检测大黄素对 E2 诱导 ERα转录活性的影响  27
    2.2.6 Western blotting 方法检测相关蛋白表达  27-30
    2.2.7 统计学分析  30
  2.3 实验结果  30-36
    2.3.1 大黄素对人乳腺癌细胞 MCF-7 和 MDA-MB-231 增殖的影响  30-31
    2.3.2 大黄素对 E2 促 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞增殖的影响  31
    2.3.3 大黄素对 E2 诱导 MCF-7 细胞周期分布及抗凋亡作用的影响  31-32
    2.3.4 大黄素对 MCF-7 细胞中 ERα蛋白表达的影响  32
    2.3.5 大黄素对 E2 诱导 ERα转录活性的影响  32-34
    2.3.6 大黄素对 E2 诱导 ERα靶基因蛋白 Cyclin D1 和 Bcl-2 表达的影响  34-35
    2.3.7 大黄素对 E2 诱导 Akt 蛋白及 MAPK 蛋白磷酸化水平的影响  35-36
  2.4 讨论  36-38
  2.5 小结  38-39
3 大黄素体外免疫调节及溶血作用的研究  39-47
  3.1 实验材料  40
    3.1.1 材料和试剂  40
    3.1.2 主要仪器  40
  3.2 实验方法  40-43
    3.2.1 尼龙毛柱法分离小鼠 T、B 淋巴细胞  40-41
    3.2.2 分离小鼠腹腔巨噬细胞  41
    3.2.3 大黄素对小鼠 T、B 淋巴细胞增殖的影响  41
    3.2.4 大黄素对小鼠腹腔巨噬细胞活力及吞噬功能的影响  41
    3.2.5 大黄素对小鼠 NK 细胞活性的影响  41-42
    3.2.6 大黄素体外溶血作用  42
    3.2.7 统计分析  42-43
  3.3 实验结果  43-45
    3.3.1 大黄素对小鼠腹腔巨噬细胞代谢活力的影响  43-44
    3.3.2 大黄素对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响  44
    3.3.3 大黄素对小鼠 NK 细胞活性的影响  44
    3.3.4 大黄素对小鼠脾脏 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞增殖的影响  44-45
    3.3.5 大黄素体外溶血作用  45
  3.4 讨论  45-46
  3.5 小结  46-47
4 结论与展望  47-49
  4.1 本研究结论  47-48
  4.2 本研究有待于深入的内容  48-49
5 本研究创新点  49-50
参考文献  50-56
附录 A 缩略词  56-57
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  57-58
致谢  58

大黄素抗乳腺癌作用与ERα信号通路之间的关系及免疫调节的研究

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