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CLIP-170对乳腺肿瘤血管新生及紫杉醇敏感性的调节

作　者: 孙晓东
导　师: 周军
学　校: 南开大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 细胞质连接蛋白170 乳腺癌 肿瘤血管新生 紫杉醇 细胞迁移 细胞凋亡
分类号: R737.9
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


CLIP-170通过其氨基末端的CAP-Gly结构域与微管结合,是经典的微管结合蛋白之一。现在已经很清楚CLIP-170定位于微管末端,并且调节微管动态性。CLIP-170还被揭示参与微管相关的多种细胞内活动,如有丝分裂过程中着丝粒——微管连接的形成,细胞定向迁移等。CLIP-170在这些细胞活动中的功能主要通过其对于微管动态性调节的机制介导的。另外,CLIP-170还被揭示能够调节人乳腺癌细胞的片状伪足的形成和调控乳腺癌细胞的侵袭能力。CLIP-170与IQGAP1蛋白,kinesin蛋白和Racl蛋白形成复合体调控细胞的侵袭和片状伪足的形成。肿瘤相关的血管新生涉及到肿瘤微环境中多种细胞之间复杂的相互影响。肿瘤血管新生这种显著的特性为临床寻找治疗靶点的增加了机会。在肿瘤治疗和控制过程中,我们可以尝试靶向血管新生的多个方面。尽管现在抗血管新生的方案在多种类型肿瘤医治过程中发挥作用,但是为了提高治疗效果还需要去寻找鉴定更多的抗血管生成的靶标。我们的工作发现微管结合蛋白CLIP-170在乳腺癌样品中表达水平较高,并且还发现CLIP-170的表达量与肿瘤组织中的血管密度有正相关的联系。同时,我们的实验证明血管内皮细胞中CLIP-170表达量的降低能够显著降低其体外成管能力和出芽能力。我们还发现CLIP-170的表达水平的降低还能影响小鼠体内乳腺癌移植瘤血管形成而抑制肿瘤生长。我们的研究数据进一步揭示CLIP-170蛋白影响血管内皮细胞的迁移能力,而不影响其增殖水平。另外,我们还发现CLIP-170能够应答血管新生刺激而促进内皮细胞的极化。这些发现证明CLIP-170在肿瘤血管新生中具有关键作用并认为其可以作为一个潜在的新的抗血管新生靶点。我们的研究还首次报道了CLIP-170通过微管依赖性的机制调节乳腺癌细胞对紫杉醇的药物敏感性。这项研究揭示了CLIP-170在调节紫杉醇敏感性方面尚未明确的功能。我们通过体外细胞增殖实验证明了CLIP-170的表达水平和乳腺癌细胞对紫杉醇敏感性存在相关性。更为重要的是,我们发现CLIP-170在乳腺癌样品中的表达水平与对应患者临床应用紫杉醇化疗的病理应答相关。我们通过对乳腺癌细胞的有丝分裂指标和caspase-3舌性分析发现CLIP-170能够提高紫杉醇阻滞细胞有丝分裂周期进程并引起细胞凋亡。通过微管沉降实现和结合亲和力的分析,我们进一步发现CLIP-170能够提高紫杉醇结合到微管的能力。体外微管聚合实验表明CLIP-170蛋白能够加强紫杉醇促进微管组装的能力。这些结果证明CLEP-170以微管依赖性的机制调节乳腺癌中紫杉醇的敏感性。众所周知,特定的微管结合蛋白能够影响以微管为靶点的药物与微管结合的能力。这些功能的实现是通过微管结构或构象的变化而实现的,进而可以影响药物的敏感性和控制肿瘤的生长。既然CLIP-170在乳腺癌中高表达,并且和血管密度存在相关关系,那么我们可以立足于内皮细胞开发一些可能有益的肿瘤治疗方案。例如,单纯降低CLIP-170的表达,或者与其他治疗方案一起抑制乳腺癌的发展。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-13
第一章 引言  13-51
  第一节 CLIP-170是一种典型的微管正端示踪蛋白  13-26
    1.1.1 CLIP-170蛋白的结构与功能  13-15
    1.1.2 CLIP-170蛋白在微管末端结合机制  15-18
    1.1.3 CLIP-170蛋白对微管动态性的调节  18-22
    1.1.4 微管正端示踪蛋白的功能  22-24
    1.1.5 生长的微管末端是微管正端示踪蛋白发挥作用的平台  24-26
  第二节 细胞迁移与肿瘤血管新生  26-37
    1.2.1 细胞迁移中的微管的角色  27-28
    1.2.2 Rho GTP酶对迁移细胞中微管功能的调节  28-30
    1.2.3 微管正端通过多重机制与细胞皮层连接  30-33
    1.2.4 肿瘤的侵袭转移与血管新生  33-37
  第三节 微管为靶点的抗肿瘤药物  37-51
    1.3.1 微管为靶点药物研究的理论基础  38-41
    1.3.2 长春碱类药物作用机制  41-43
    1.3.3 紫杉醇类药物作用机制  43-45
    1.3.4 微管为靶点的药物作用于肿瘤血管  45-46
    1.3.5 微管为靶点药物的发展现状与远景  46-51
第二章 研究技术与方法  51-61
  第一节 材料、试剂与设备  51-54
    2.1.1 实验用哺乳动物细胞  51
    2.1.2 实验用原核感受态细胞  51
    2.1.3 实验所用质粒  51-52
    2.1.4 实验所用抗体  52
    2.1.5 实验用主要药品试剂  52-53
    2.1.6 实验用仪器设备  53-54
  第二节 实验方法  54-61
    2.2.1 贴壁细胞培养及传代  54
    2.2.2 质粒转染  54-55
    2.2.3 siRNA的转染  55
    2.2.4 免疫荧光染色实验  55-56
    2.2.5 Western blotting检测  56
    2.2.6 SRB测试细胞增殖情况  56-57
    2.2.7 流式细胞仪检测细胞周期  57
    2.2.8 细胞划痕愈合实验  57
    2.2.9 细胞Transwell侵袭实验  57-58
    2.2.10 血管内皮细胞成管实验  58
    2.2.11 三维毛细血管出芽形成实验  58-59
    2.2.12 血管内皮细胞极化实验  59
    2.2.13 融合蛋白GST-CLIP-170的诱导表达  59
    2.2.14 石蜡组织切片免疫组化实验  59-61
第三章 微管相关蛋白CLIP-170调节肿瘤血管新生  61-86
  第一节 人乳腺癌组织中CLIP-170表达量较正常乳腺组织高  62-67
    3.1.1 CLIP-170在人乳腺癌组织中高表达  62-64
    3.1.2 CLIP-170低表达对肿瘤细胞增殖的影响不明显  64-65
    3.1.3 乳腺癌组织中CLIP-170的表达水平与血管密度正相关  65-67
  第二节 CLIP-170表达量降低能抑制小鼠体内肿瘤血管新生  67-71
    3.2.1 CLIP-170表达量降低抑制小鼠体内肿瘤生长  67-69
    3.2.2 CLIP-170表达量降低能够抑制肿瘤血管形成  69-71
  第三节 血管内皮细胞中CLIP-170表达量的降低损害其成管能力和出芽能力  71-77
    3.3.1 肿瘤细胞培养基能够显著提高HUVEC细胞中CLIP-170的表达水平  71-72
    3.3.2 CLIP-170表达量的降低损害血管内皮细胞成管能力  72-74
    3.3.3 CLIP-170过表达能够促进血管内皮细胞成管能力  74-75
    3.3.4 CLIP-170表达量的降低损害血管内皮细胞出芽能力  75-77
  第四节 CLIP-170对内皮细胞的迁移很重要,但是不影响其增殖能力  77-82
    3.4.1 CLIP-170对内皮细胞的迁移很重要  77-80
    3.4.2 CLIP-170表达水平的降低不影响内皮细胞的细胞周期  80-81
    3.4.3 内皮细胞中CLIP-170表达量的降低对其增殖能力无显著影响  81-82
  第五节 CLIP-170影响细胞迁移中细胞极化过程  82-86
    3.5.1 CLIP-170对细胞极化很重要  82-83
    3.5.2 CLIP-170影响迁移细胞前端膜动态性  83-86
第四章 微管结合蛋白CLIP-170对紫杉醇(paclitaxel)敏感性的调节  86-105
  第一节 乳腺癌细胞CLIP-170表达量与其对紫杉醇敏感性相关  86-90
    4.1.1 CLIP-170在不同乳腺癌细胞系中的表达量不尽相同  87
    4.1.2 不同乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性不同  87-88
    4.1.3 CLIP-170表达量与乳腺癌细胞对紫杉醇敏感性相关  88-90
  第二节 改变CLIP-170表达量影响紫杉醇的敏感性  90-92
    4.2.1 CLIP-170表达量的增加影响MCF-7细胞对紫杉醇的敏感性  90-91
    4.2.2 CLIP-170表达量的降低导致MCF-7细胞对紫杉醇的敏感性迟钝  91-92
  第三节 CLIP-170表达预示应用紫杉醇化疗的肿瘤病理反应  92-96
    4.3.1 乳腺癌临床样品中CLIP-170的表达情况  92-93
    4.3.2 乳腺癌临床样品中CLIP-170的表达量与患者紫杉醇化疗的病理应答相关  93-94
    4.3.3 乳腺癌临床样品肿瘤周边组织中CLIP-170的表达情况及患者化疗病理应答的分析  94-96
  第四节 CLIP-170能够提高紫杉醇引起细胞有丝分裂阻止和细胞凋亡的能力  96-101
    4.4.1 过表达CLIP-170能够提高紫杉醇引起MCF7细胞有丝分裂阻止能力  96-98
    4.4.2 过表达CLIP-170能够提高紫杉醇引起MCF7细胞凋亡的能力  98-101
  第五节 CLIP-170促进紫杉醇与微管结合  101-103
    4.5.1 CLIP-170以浓度依赖的方式促进紫杉醇与微管结合  101-102
    4.5.2 CLIP-170提高紫杉醇与微管的亲和力  102-103
  第六节 CLIP-170提高紫杉醇促进微管组装的能力  103-105
    4.6.1 CLIP-170能促进微管体外组装  103
    4.6.2 CLIP-170能以浓度依赖性的方式提高紫杉醇促进微管组装的能力  103-105
第五章 研究讨论与展望  105-111
  第一节 CLIP-170在肿瘤血管新生中的作用机制  105-108
    5.1.1 CLIP-170是乳腺癌血管新生的作用关键因子  105-106
    5.1.2 CLIP-170调节血管内皮细胞迁移能力  106-108
  第二节 CLIP-170调节乳腺癌中紫杉醇的敏感性  108-111
    5.2.1 CLIP-170能够影响乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性  108-109
    5.2.2 CLIP-170可以作为乳腺癌防治中的重要因素  109-111
参考文献  111-124
致谢  124-125
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  125
  个人简历  125
  在学期间发表的学术论文  125

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 乳腺肿瘤
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