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抑癌基因ATBF1对乳腺上皮细胞分化和乳腺发育的影响及其分子机制研究

作　者: 李梅
导　师: 董金堂
学　校: 南开大学
专　业: 遗传学
关键词: ATBF1 雌激素受体 孕激素受体 乳腺上皮细胞 乳腺发育
分类号: R737.9
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


乳腺癌是世界范围内危害女性健康最常见的一类肿瘤,发病率居于女性各类恶性肿瘤首位。近年来,得益于科学研究的深入和医疗条件的提升,乳腺癌的致死率已显著下降,但依然还有大量的乳腺癌相关基因和肿瘤发病机理有待深入挖掘,为临床预防、诊断和治疗提供支持与指导。AT-motif binding factor1(ATBF1)是已知的重要抑癌基因,其基因所在染色体区域在多种癌症包括乳腺癌中频繁缺失。乳腺癌中,ATBF1表达下调与各类临床诊断指标密切相关(肿瘤大小,肿瘤分级,ER阳性等)。我们的前期结果表明,在乳腺癌细胞中,ATBF1可以直接与雌激素受体(estrogen receptor, ER)相互作用,共同结合到ER下游靶基因启动子区,抑制重要靶基因的表达,从而抑制细胞增殖。此外,孕激素受体(progesterone receptor, PR)是ER重要下游基因,雌激素处理上调PR表达,而且大多数ER阳性的肿瘤同为PR阳性。ER和PR均为乳腺癌临床诊断的重要指标,关于其机理的研究具有重要的乳腺癌治疗指导意义。本论文分别从estrogen-ER信号通路和progesterone-PR信号通路两方面阐述ATBF1在乳腺上皮细胞增殖(cell proliferation)、分化(cell differentiation),乳腺发育(mammary gland development)及乳腺癌发生发展过程中的作用。第一部分：ATBF1对乳腺上皮细胞分化和青春期乳腺发育的影响,及其分子机制,特别是ATBF1对estrogen-ER信号通路的影响。在正常乳腺发育过程中,雌激素主要分泌于青春期,促进导管的延伸与分枝。卵巢切除和ER敲除都会严重抑制青春期乳腺导管的发育。基于前期乳腺癌细胞系中的研究结果(ATBF1与雌激素及其受体的关系),我们着重探索乳腺青春期发育阶段Atbfl的功能。在体外,我们将永生化的正常乳腺上皮细胞MCF10A培养于Matrigel中,诱导细胞分化。结果发现,该过程中,ATBF1mRNA和蛋白水平均显著上调。利用siRNA敲减ATBF1后,MCF10A细胞在Matrigel中培养形成乳腺微球的能力显著下降。由此提示我们ATBF1很可能参与并影响乳腺上皮细胞的分化过程。为了进一步在体内研究Atbfl对乳腺上皮细胞增殖分化的影响,我们首先利用real time PCR和免疫荧光的方法检测乳腺发育不同时期Atbfl的表达与定位。研究表明,Atbfl在乳腺发育不同阶段表达差异显著：青春期Atbfl表达逐步上升；孕期处于较低水平而哺乳期Atbfl表达最高。小鼠乳腺组织中,Atbf1主要定位于乳腺上皮细胞,而且在腺上皮细胞和肌上皮细胞中均有表达。其次,我们利用MMTV-Cre介导的Atbf1乳腺特异性敲除小鼠研究Atbf1在乳腺发育过程中的影响。乳腺全组织染色表明,Atbf1敲除后显著促进青春期导管的延伸和分枝,加快成熟导管和导管末端TEB结构中的上皮细胞增殖,而且有意思的是这种细胞增殖加快主要发生在ER阳性的细胞中。与此同时,ER下游靶基因(Areg, Igf-1, Ebag9和c-myc)的表达也显著上调。此外,MCF10A细胞中ATBF1敲减和小鼠乳腺组织中Atbf1敲除后,乳腺上皮细胞基底细胞marker (CK5, CK14和CD44)表达均显著下调,但不影响腺上皮细胞1narker(CK8, CK18和CD24)的表达。总的来说,研究结果表明Atbf1在青春期乳腺发育过程中起重要作用,这种作用很可能是通过调节腺上皮细胞中estrogen-ER信号通路和基底细胞marker表达来实现。第二部分：ATBF1参与调控progesterone-PR信号通路,影响细胞干性。近期研究发现,孕激素是一个重要的调节乳腺上皮细胞干性(stem cell),乳腺发育和乳腺癌发生发展的荷尔蒙。我们的研究发现,ATBF1是重要的Pg-PR信号通路的靶基因。在乳腺癌细胞系T-47D和正常小鼠体内分别用孕激素处理后,RNA和蛋白水平的ATBF1表达均显著上调。进一步研究发现,孕激素诱导ATBF1表达依赖于孕激素受体(progesterone receptor, PR)的表达与激活。只有在PR阳性的细胞中,孕激素才能上调ATBF1表达；而在PR阴性的细胞,孕激素处理基本不影响ATBF1水平。PR拮抗剂RU-486预处理细胞或者siRNA敲减PR表达后,ATBF1表达不再受孕激素的诱导。此外,启动子报告分析(promoter-reporter assay)和染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)实验表明孕激素激活的PR可以直接结合到ATBF1启动子上,从而激活ATBF1转录。功能研究方面,我们利用Matrigel克隆形成和乳腺干细胞分子marker (CD49f和CD44)分析发现,孕激素能诱导成熟分化的细胞向干细胞／祖细胞(stem cell/progenitor cell)转化,而ATBF1敲减显著抑制该过程。这些研究结果都提示我们ATBF1参与乳腺上皮细胞Pg-PR信号通路,并影响孕激素对细胞干性的调节。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-14
第一章 引言  14-34
  第一节 乳腺癌简介  14-15
    1.1.1 乳腺癌与人类健康  14
    1.1.2 乳腺结构与功能  14-15
  第二节 乳腺分化发育及其与乳腺癌的关系  15-23
    1.2.1 乳腺分化发育概述  15
    1.2.2 胚胎期小鼠乳腺发育及其分子机制  15-17
    1.2.3 出生后小鼠乳腺发育及其分子机制  17-20
    1.2.4 乳腺上皮细胞分化  20-21
    1.2.5 乳腺分化发育与乳腺癌关系研究  21-23
  第三节 激素与乳腺发育及乳腺癌的关系  23-28
    1.3.1 雌激素与乳腺发育  23-25
    1.3.2 雌激素与乳腺癌  25-26
    1.3.3 孕激素与乳腺发育  26-28
    1.3.4 孕激素与乳腺癌  28
  第四节 ATBF1与组织发育及乳腺癌的关系  28-34
    1.4.1 ATBF1基因概述  28-30
    1.4.2 ATBF1与组织发育  30-31
    1.4.3 ATBF1与乳腺癌发生发展  31-32
    1.4.4 ATBF1与雌激素受体(ER)  32-34
第二章 研究目标和研究意义  34-36
  第一节 研究目标  34
  第二节 研究意义  34-36
第三章 实验材料与方法  36-57
  第一节 实验材料  36-40
    3.1.1 细胞系  36
    3.1.2 小鼠  36
    3.1.3 主要试剂及试剂盒  36-37
    3.1.4 抗体  37-38
    3.1.5 引物及siRNA  38-40
    3.1.6 SDS-PAGE配制  40
  第二节 实验方法  40-57
    3.2.1 小鼠编号及基因型检测  41-43
    3.2.2 RNA提取,RT-PCR及real time PCR  43-46
    3.2.3 蛋白裂解液提取及Western blotting  46-48
    3.2.4 MCF10A三维培养(Matrigel)  48-49
    3.2.5 乳腺组织的全组织染色  49-50
    3.2.6 组织切片的免疫组化和免疫荧光染色  50-51
    3.2.7 组织切片的HE染色  51
    3.2.8 双荧光素酶报告基因系统分析启动子活性  51-52
    3.2.9 染色体免疫共沉淀(ChIP)  52-53
    3.2.10 细胞免疫荧光  53-54
    3.2.11 T-47D的Matrigel培养  54-55
    3.2.12 流式细胞仪分析细胞周期  55
    3.2.13 体外细胞增殖实验  55
    3.2.14 实验数据统计分析  55-57
第四章 Atbf1敲除促进青春期乳腺导管发育  57-84
  第一节 研究目的  57
  第二节 实验结果  57-77
    4.2.1 Matrigel诱导MCF10A细胞分化  57-59
    4.2.2 MCF10A分化过程中ATBF1表达显著上调  59-61
    4.2.3 ATBF1敲减对MCF10A细胞分化的影响  61-63
    4.2.4 Atbf1在小鼠乳腺发育过程中的表达及乳腺组织中的定位  63-65
    4.2.5 Atbf1乳腺特异性敲除小鼠的构建及鉴定  65-66
    4.2.6 Atbf1敲除促进青春期乳腺导管发育  66-67
    4.2.7 Atbf1敲除对乳腺上皮细胞增殖的影响  67-73
    4.2.8 Atbf1敲除对乳腺上皮细胞组织排列及分化的影响  73-75
    4.2.9 Atbf1敲除在小鼠存活和乳腺成瘤中的作用  75-77
    4.2.10 小结  77
  第三节 实验分析与讨论  77-84
    4.3.1 Atbf1调节青春期乳腺发育  78
    4.3.2 Atbf1对乳腺上皮细胞增殖的影响仅局限在ER阳性的细胞中  78-80
    4.3.3 ATBF1与细胞分化相关  80-82
    4.3.4 Atbf1是一个新发现的调节乳腺发育和乳腺癌发生发展的基因  82-84
第五章 ATBF1参与调控Pg-PR信号通路  84-96
  第一节 研究目的  84
  第二节 实验结果  84-93
    5.2.1 孕激素处理上调乳腺癌细胞系中ATBF1表达  84-85
    5.2.2 孕激素处理上调小鼠乳腺上皮细胞中Atbf1表达  85-86
    5.2.3 PR是孕激素诱导ATBF1表达的关键  86-87
    5.2.4 PR可直接结合到ATBF1启动子上激活AATBF1转录  87-90
    5.2.5 ATBF1敲减抑制Pg诱导的祖细胞转化  90-91
    5.2.6 ATBF1调节Pg-PR信号通路下游相关基因表达  91-92
    5.2.7 ATBF1敲减和Pg处理不影响细胞增殖  92-93
    5.2.8 小结  93
  第三节 实验分析与讨论  93-96
    5.3.1 ATBF1是介导Pg-PR信号通路的关键转录因子  93-94
    5.3.2 ATBF1很可能参与Pg诱导的祖细胞转化,影响乳腺癌发生发展  94-95
    5.3.3 Atbf1可能调节乳腺发育的多个阶段  95-96
第六章 结论与展望  96-98
  第一节 结论  96
  第二节 展望  96-98
参考文献  98-112
致谢  112-114
个人简历、在学期间发表的学术论文及科研成果  114

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 乳腺肿瘤
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