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TLR2信号通路对人乳腺癌细胞转移侵袭作用的研究

作　者: 孙晓洁
导　师: 杨桂文；安利国
学　校: 山东师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 人乳腺癌 Toll样受体2 肿瘤转移 LTA 信号通路
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

乳腺癌是女性癌症患者中最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌细胞的转移性是引起乳腺癌患者死亡的主要原因，也是乳腺癌治疗中的最大难题之一。因此研究乳腺癌的预防与临床治疗倍受关注，研究乳腺癌细胞转移侵袭机制对乳腺癌的治疗具有重要的意义。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是进化上十分保守的重要模式识别受体（PPRs），主要表达于人类免疫细胞和上皮细胞中。通过识别病原相关分子模式(PAMPs)，在机体先天性免疫反应发生过程中发挥关键作用。近来研究发现，TLRs在包括乳腺癌在内的人类恶性肿瘤细胞表面均有表达，并在肿瘤的发生发展和转移侵袭过程中发挥重要功能。实验室前期研究发现，Toll样受体2(toll-like receptor2，TLR2)在两种乳腺癌细胞MDA-MB-231（高转移性乳腺癌细胞系）和MCF-7（低转移性乳腺癌细胞系）中的表达有较大差异，即高表达于MDA-MB-231细胞而低表达于MCF-7细胞，其表达量相差约1500倍。TLR2的表达差异是否为导致两种细胞转移侵袭能力差别的主要原因所在？其机制是怎样的？为解决这些问题，本课题即以两种乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7为研究对象，以LTA作为TLR2的激活剂，特异性的激活TLR2信号通路，研究TLR2信号通路对乳腺癌细胞转移侵袭能力的影响，探讨TLR2信号通路在肿瘤转移侵袭过程中的作用机制，为恶性肿瘤的发生发展及转移机制的研究提供理论基础。本研究利用MTT法、细胞创口愈合实验、Transwell基质胶侵袭实验以及软琼脂克隆形成实验检测了LTA刺激后两种乳腺癌细胞的体外增殖能力、转移侵袭能力和非锚定生长能力，发现LTA刺激均能使两种乳腺癌细胞的增殖能力有所提高，MDA-MB-231细胞在接受刺激后增殖能力是未接受刺激的对照组的接近2倍，其增强幅度明显明显高于MCF-7，且LTA刺激后的MDA-MB-231细胞的转移侵袭能力和非锚定生长能力相比对照组其增强幅度均要明显高于MCF-7细胞。进而我们将两种细胞表面的TLR2用特异性抗体封闭后，发现两种细胞的转移侵袭能力和非锚定生长能力相对于未进行TLR2封闭的细胞均发生了不同程度的降低，MDA-MB-231的各种能力的降低幅度也明显高于MCF-7。由此我们认为TLR2表达量的不同是造成两种细胞转移侵袭能力不同的关键因素。利用ELISA实验技术检测了两种细胞在LTA刺激后肿瘤转移相关因子VEGF、IL-6和TGF-β1的表达情况以及在TLR2中和抗体封闭作用后两种细胞肿瘤转移相关因子的表达分泌的变化情况，发现LTA刺激后MDA-MB-231细胞的VEGF、IL-6和TGF-β1分泌量均明显提高，其提高幅度分别是MCF-7细胞的1.5倍、1.3倍和1.2倍。而TLR2抗体封闭作用后的两种细胞的肿瘤转移相关因子的分泌情况均降低，MDA-MB-231细胞降低幅度明显高于MCF-7细胞。因此我们推断，LTA可能是通过激活TLR2信号通路进而诱导肿瘤转移相关因子的分泌来影响了人乳腺癌细胞的转移侵袭能力的变化。最后，利用JNK抑制剂SP600125抑制TLR2介导的信号通路下游关键激酶JNK的活性，检测到两种细胞在JNK激酶活性受到抑制后，LTA刺激引起的细胞转移侵袭能力和非锚定生长能力均受到了不同程度的抑制，对MDA-MB-231细胞的抑制程度要明显高于MCF-7细胞。说明了JNK在TLR2信号通路介导的人乳腺癌细胞转移侵袭作用机制中发挥了重要作用。综上所述，本课题通过对TLR2信号通路在两种乳腺癌细胞转移侵袭过程中作用进行探究，并对其可能涉及的分子机制的进行初步探究，为乳腺癌细胞转移与浸润的研究提供了新的线索，为乳腺癌的临床治疗提供了理论基础。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-11
综述  11-17
  1 TLR 信号通路概述  11-13
  2 TLR2 信号通路的调控  13-14
  3 TLR2 激活剂 LTA  14-15
  4 TLR2 与肿瘤  15-16
    4.1 TLR2 对肿瘤增殖作用的影响  15
    4.2 TLR2 对肿瘤转移侵袭作用的影响  15-16
  5 结语  16-17
实验部分 TLR2 信号通路对人乳腺癌细胞转移侵袭作用的研究  17-51
  前言  17-21
  第一章 LTA 刺激对两种乳腺癌细胞转移侵袭能力的影响  21-37
    1.1 实验材料与试剂  21
    1.2 实验方法  21-24
      1.2.1 人乳腺癌细胞的培养  21
      1.2.2 细胞增殖活力检测  21-22
      1.2.3 细胞创口愈合实验  22-23
      1.2.4 Transwell 基质胶细胞侵袭实验  23
      1.2.5 软琼脂克隆形成实验  23-24
    1.3 实验结果  24-35
      1.3.1 LTA 刺激对人乳腺癌细胞增殖活力的影响  24-26
      1.3.2 LTA 刺激对人乳腺癌细胞转移能力的影响  26-30
      1.3.3 LTA 刺激对人乳腺癌细胞侵袭能力的影响  30-32
      1.3.4 LTA 刺激对人乳腺癌细胞非锚定生长能力的影响  32-35
    1.4 本章小结  35-37
  第二章 LTA 刺激对人乳腺癌细胞转移相关因子表达的影响  37-43
    2.1 实验材料与试剂  37
    2.2 实验方法  37-38
      2.2.1 人乳腺癌细胞培养以及 LTA 处理  37
      2.2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）  37-38
    2.3 实验结果  38-41
      2.3.1 LTA 刺激对人乳腺癌细胞 VEGF 表达情况的影响  38-39
      2.3.2 LTA 刺激对人乳腺癌细胞 IL-6 表达情况的影响  39-40
      2.3.3 LTA 刺激对人乳腺癌细胞 TGF-β1 表达情况的影响  40-41
    2.4 本章小结  41-43
  第三章 TLR2 信号通路阻断剂处理对两种乳腺癌细胞转移侵袭能力影响的研究  43-51
    3.1 实验材料与试剂  43
    3.2 实验方法  43
    3.3 实验结果  43-50
      3.3.1 JNK 阻断剂对 LTA 诱导的人乳腺癌细胞转移能力变化的影响  43-46
      3.3.2 JNK 阻断剂对 LTA 诱导的人乳腺癌细胞侵袭能力变化的影响  46-48
      3.3.3 JNK 阻断剂对 LTA 诱导的人乳腺癌细胞非锚定生长能力变化的影响  48-50
    3.4 本章小结  50-51
讨论  51-54
结论  54-55
参考文献  55-60
附录 1 主要仪器设备和常用试剂的配制  60-62
附录 2 英文缩写词  62-65
致谢  65

TLR2信号通路对人乳腺癌细胞转移侵袭作用的研究

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