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HIES疾病中STAT3突变体的功能研究

作 者: 何建新
导 师: 导师小组
学 校: 兰州大学
专 业: 细胞生物学
关键词: STAT3 白介素-6 JAK/STAT信号通路 DNA结合区 SH2区 高免疫球蛋白E综合症
分类号: R593
类 型: 博士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


背景高免疫球蛋白E综合症(HIES)是一种罕见的免疫系统缺陷疾病。它的主要临床病征为皮肤周期性感染金黄色葡萄球菌、肺部感染肺炎球菌形成肺囊肿,伴随有骨骼及软组织病变以及患者体内分泌高水平的免疫球蛋白E。HIES可分为常染色体显性(AD-HIES)疾病和常染色体隐性(AR-HIES)疾病。JAK-STAT信号通路在调节人体各个器官发育以及免疫系统发生方面都发挥着重要作用。最近的研究表明信号转导及转录激活因子3(STAT3)基因发生的显性负效应点突变、移码突变或缺失突变是导致AD-HIES发病的主要原因。越来越多的临床证据显示在大多数AD-HIES患者中,至少一条STAT3等位基因存在一个单一位点的突变,而随之产生的突变STAT3蛋白往往会对另一个正常等位基因表达的STAT3蛋白产生显性负效应,导致STAT3蛋白功能紊乱,最终引起HIES的发生。目的在HIES疾病中,STAT3突变位点主要集中在自身的DNA结合区及SH2区。对STAT3突变蛋白在JAK-STAT信号通路各个环节的功能研究并不系统,同时对于突变蛋白如何对野生型STAT3蛋白产生显性负效应的机理也研究甚少。因此有必要在分子水平上研究DNA结合区及SH2区突变STAT3蛋白的功能以及它们与野生型STAT3蛋白的相互作用,为进一步阐释突变STAT3在HIES病人细胞内的信号转导过程及显性负效应的产生机制打下基础。方法本研究以STAT3基因敲除细胞系A4为材料,首先利用PCR定点突变技术构建STAT3点突变cDNA,其次利用慢病毒(Lenti-Virus)感染系统将突变STAT3cDNA转入并整合到A4细胞系的基因组中,最后利用分子生物学及分子模拟手段研究突变STAT3蛋白在IL-6/JAK-STAT信号通路中的磷酸化、二聚化、核-质分布、DNA结合能力以及对下游基因的转录能力;同时通过研究突变型STAT3蛋白与野生型STAT3蛋白之间的二聚化,来初步探讨突变STAT3对野生型STAT3蛋白的显性负效应。结果1.构建融合Flag标签的野生型及突变型STAT3cDNA慢病毒表达载体,同时构建融合HA标签的野生型及突变型STAT3cDNA常规表达载体。这些突变体均发现于病征明显的AD-HIES患者中。其中,H332Y、R382W、R382Q、F384S和R423Q突变位点存在于STAT3的DNA结合区,S611N和F621V突变位点存在于STAT3的SH2区。2.以STAT3基因缺失的人结肠癌细胞株A4为感染对象,通过病毒感染及筛选,得到能够分别表达融合Flag标签的野生型和突变STAT3蛋白的细胞株。Western blot结果显示A4重组细胞株中STAT3蛋白的表达量是母细胞株DLD1中STAT3蛋白表达量的10倍。3. Western blot结果显示,STAT3DNA结合区突变蛋白拥有705位酪氨酸残基磷酸化的能力,而SH2区突变蛋白失去了705位酪氨酸残基的磷酸化能力。4.在响应白介素-6刺激时,727位的丝氨酸残基磷酸化在7个STAT3突变体中表现出多样化,未受到突变位点的影响。5.免疫共沉淀结果显示,STAT3DNA结合区突变的蛋白能形成同型二聚体,而SH2区突变蛋白不能形成同型二聚体,提示不同区域突变的STAT3蛋白在细胞信号通路的不同阶段引起自身功能缺陷。6.免疫荧光及核-质蛋白分离实验显示,无论是否有白介素-6刺激,DNA结合区及SH2区的突变均不影响STAT3蛋白在细胞核-细胞质中的分布,表明突变并未影响STAT3蛋白在细胞核-质中的运输。7.凝胶电泳迁移率实验结果显示,STAT3突变蛋白均不能与下游基因socs3启动子的GAS元件结合,即失去了与socs3启动子的结合能力;分子模拟实验显示STAT3DNA结合区突变蛋白与c-fos启动子GAS元件的结合能力均有不同程度的下降,表明突变不同程度地削弱了STAT3蛋白的DNA结合能力。8.实时荧光定量PCR结果显示,携带突变STAT3cDNA的重组细胞系在响应白介素-6刺激时,STAT3的下游基因socs3、c-fos和c-jun的表达水平均有不同程度的下降。socs3基因的表达完全受到抑制,c-fos和c-jun基因的表达在不同的STAT3突变细胞系中下降程度不同,表明突变引起STAT3蛋白转录能力下降。9.免疫共沉淀结果显示尽管失去705位酪氨酸磷酸化能力,在响应白介素-6刺激时,SH2区突变STAT3蛋白依然能够与野生型STAT3蛋白形成二聚体,这有可能是导致HIES病人细胞内野生型STAT3蛋白功能缺陷的原因。结论1.揭示了来源于HIES中STAT3突变体的功能缺陷,证明这些STAT3突变体导致IL-6/JAK-STAT信号通路紊乱;2.证明在响应白介素-6刺激时,来源于HIES的STAT3SH2区突变蛋白能够与野生型STAT3蛋白形成二聚体。这些结论对进一步了解HIES的发病机理及对寻找疾病的治疗途径提供了理论支持。

全文目录


摘要  3-6
Abstract  6-9
缩略词表  9-15
第一章 绪论  15-32
  1.1 STAT家族  16-19
    1.1.1 STAT蛋白结构  16-17
    1.1.2 STAT家族成员  17-18
    1.1.3 STAT蛋白的修饰  18-19
  1.2 JAK-STAT信号通路  19-22
    1.2.1 JAK-STAT信号通路概述  20
    1.2.2 JAK家族  20-22
  1.3 STAT3研究进展  22-27
    1.3.1 STAT3的结构和功能概述  23
    1.3.2 STAT3与癌症的关系  23-24
    1.3.3 STAT3与其它疾病的关系  24-25
    1.3.4 IL-6/JAK-STAT3信号通路  25-27
  1.4 高免疫球蛋白E综合症(HIES)  27-30
    1.4.1 HIES的发病特征  28-29
    1.4.2 基因突变与HIES的关系  29-30
  1.5 本研究的背景和内容  30-32
第二章 构建表达突变STAT3 cDNA的质粒载体  32-51
  摘要  32
  2.1 材料  32-35
    2.1.1 质粒载体  32-34
    2.1.2 主要溶液配制  34
    2.1.3 分子生物学软件  34
    2.1.4 主要试剂  34-35
    2.1.5 仪器和设备  35
  2.2 方法  35-41
    2.2.1 人野生型Flag-tagged STAT3 cDNA病毒载体的构建  35-37
    2.2.2 突变型Flag-tagged STAT3 cDNA病毒载体的构建  37-39
    2.2.3 人HA-tagged STAT3 cDNA表达载体的构建  39-41
  2.3 结果  41-48
    2.3.1 人野生型Flag-tagged STAT3 cDNA的克隆  41
    2.3.2 构建含野生型Flag-tagged STAT3 cDNA的病毒载体  41
    2.3.3 构建含点突变Flag-tagged STAT3 cDNA的病毒载体  41
    2.3.4 点突变STAT3 cDNA的突变位点序列测定  41-47
    2.3.5 人野生型及突变型HA-tagged STAT3 cDNA的克隆  47
    2.3.6 构建pEGFP-N1-HA-tagged STAT3 cDNA表达载体  47-48
  2.4 讨论  48-51
第三章 构建表达突变STAT3蛋白的细胞系  51-61
  摘要  51-52
  3.1 材料  52-55
    3.1.1 质粒载体  52-54
    3.1.2 使用的细胞系  54
    3.1.3 溶液配制  54-55
    3.1.4 主要试剂  55
    3.1.5 仪器设备  55
  3.2 方法  55-58
    3.2.1 细胞系培养  55
    3.2.2 包装病毒  55-56
    3.2.3 感染细胞  56-57
    3.2.4 总蛋白提取  57
    3.2.5 Western blot  57-58
  3.3 结果  58-59
    3.3.1 质粒提取  58
    3.3.2 酶消化验证病毒包装质粒  58-59
    3.3.3 验证重组细胞株中STAT3蛋白的表达量  59
  3.4 讨论  59-61
第四章 突变STAT3蛋白的磷酸化及二聚化研究  61-69
  摘要  61
  4.1 材料  61-62
    4.1.1 质粒载体  61-62
    4.1.2 溶液配制  62
    4.1.3 主要试剂  62
    4.1.4 仪器设备  62
  4.2 方法  62-64
    4.2.1 总蛋白提取  62
    4.2.2 Western blot  62
    4.2.3 质粒转染细胞  62-63
    4.2.4 免疫共沉淀实验  63-64
  4.3 结果  64-66
    4.3.1 突变对STAT3蛋白705位酪氨酸磷酸化的影响  64-65
    4.3.2 突变对STAT3蛋白727位丝氨酸磷酸化的影响  65-66
    4.3.3 STAT3突变蛋白的二聚化检测  66
  4.4 讨论  66-69
    4.4.1 不同结构域突变对STAT3蛋白磷酸化的影响  67-68
    4.4.2 不同结构域突变对STAT3蛋白二聚化的影响  68-69
第五章 突变STAT3蛋白的核-质分布研究  69-76
  摘要  69
  5.1 材料  69-70
    5.1.1 溶液配制  69
    5.1.2 主要试剂及耗材  69-70
    5.1.3 仪器设备  70
  5.2 方法  70-71
    5.2.1 免疫荧光实验  70
    5.2.2 核-质蛋白分离实验  70-71
  5.3 结果  71-74
    5.3.1 突变STAT3蛋白的核-质分布  71
    5.3.2 705位酪氨酸磷酸化STAT3蛋白的入核能力  71-74
  5.4 讨论  74-76
第六章 突变STAT3蛋白的DNA结合能力研究  76-90
  摘要  76
  6.1 材料  76-77
    6.1.1 溶液配制  76
    6.1.2 主要试剂  76-77
    6.1.3 仪器设备  77
  6.2 方法  77-80
    6.2.1 凝胶电泳迁移率(EMSAs)实验  77-78
    6.2.2 实时荧光定量PCR实验  78-79
    6.2.3 分子对接  79-80
  6.3 结果  80-86
    6.3.1 突变对STAT3蛋白DNA结合能力的影响  80-82
    6.3.2 STAT3下游基因表达量检测  82-86
  6.4 讨论  86-90
    6.4.1 不同位点突变对STAT3蛋白DNA结合能力的影响  86-88
    6.4.2 不同位点突变对STAT3下游基因表达水平的影响  88-90
第七章 突变型STAT3蛋白与野生型STAT3蛋白的二聚化研究  90-93
  摘要  90
  7.1 材料  90
  7.2 方法  90
  7.3 结果  90-92
    7.3.1 突变型STAT3蛋白与野生型STAT3蛋白的二聚化检测  90-91
    7.3.2 STAT3与gp130蛋白酪氨酸残基区核心序列比较  91-92
  7.4 讨论  92-93
结论  93-95
参考文献  95-108
在学期间的研究成果  108-109
致谢  109

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 全身性疾病 > 免疫性疾病
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