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游离脂肪酸通过Ca²⁺/calpain-2途径诱导β细胞内质网应激和凋亡的机制研究

作　者: 崔巍
导　师: 姬秋和
学　校: 第四军医大学
专　业: 内科学
关键词: 游离脂肪酸 calpain-2 β细胞内质网应激凋亡
分类号: R587.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

β细胞功能损害是2型糖尿病（Type2diabetes mellitus，T2DM）发病的主要特征之一。肥胖与T2DM都与升高的游离脂肪酸（Free fatty acids，FFA）水平有关。但是，FFA造成β细胞功能损害的分子机制尚不清楚。在本实验中，我们发现内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）的标志性分子grp78和ERS诱导的凋亡因子CHOP的表达随着FFA对β细胞作用时间的延长而呈时间依赖性的增加。FFA作用β细胞后，作为触发ERS的3个信号分子：ATF6、磷酸化的PERK和磷酸化的IRE1，它们的表达水平也显著增加。故我们证实了FFA能够诱导β细胞的ERS。我们同时发现，FFA能够促进STIM1和Orai1的结合以增加库容性的Ca²⁺内流，从而诱导ERS的发生。此外，本研究还发现calpain-2分子参与了FFA诱导的CHOP的表达并诱导了caspase12和caspase3的激活，通过这些分子信号促进了β细胞的凋亡。综上所述，Ca²⁺/calpain2通路在调节FFA诱导的β细胞ERS和凋亡中发挥了关键的作用。本实验分为四个部分：第一部分：游离脂肪酸诱发β-TC3细胞内质网应激和凋亡的研究为了检测FFA是否可以诱导β-TC3细胞的ERS，我们观察了ERS相关标志性分子的表达。ERS关键的调节分子有分子伴侣Grp78（也被称为Bip）和转录因子CHOP。在实验中,β-TC3细胞用0.5mM的FFA或者牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）分别处理0、8、16和24小时,然后两组之间进行对比观察。结果显示，相对于BSA处理过的β-TC3细胞而言，在FFA处理过的细胞中，Grp78和CHOP的mRNA及蛋白表达量均随着处理时间的延长而增加，呈现出时间依赖性的增长（P<0.05）。为了进一步评估FFA是否能够诱导β-TC3细胞的ERS，我们检测了ATF6, PERK和IRE1这3个参与ERS过程的重要信号分子的表达和磷酸化水平。我们观察到在FFA处理16小时后，β-TC3细胞ATF6、磷酸化的PERK和磷酸化的IRE1的表达与BSA处理组相比均显著增加（P<0.05）。上述的结果表明，FFA可以诱导β-TC3细胞的ERS。由于ERS可能是细胞死亡的一个中间环节，所以我们用annexin V/propidiumiodide （PI）双标染色法在FFA处理β-TC3细胞后，检测了细胞的凋亡程度。结果显示，FFA处理过的细胞凋亡水平较BSA处理过的细胞凋亡水平明显增加（P<0.05）。已知鼠源caspase-12的激活同ERS诱导的细胞凋亡相关。因此，我们还观察了β-TC3细胞caspase-12的活性水平。我们发现，在FFA处理过的β细胞中，caspase-12的激活水平与BSA处理组相比显著增加（P<0.05）。已知，在哺乳动物中，caspase-3（也被称为CPP32, apopain或者YAMA）被认为是细胞凋亡的一个关键的中间分子。故我们进一步检测了caspase-3的激活情况。我们观察到在FFA处理过的细胞中，caspase-3的激活水平与BSA处理组相比显著提高（P<0.05）。从以上所有的结果可以得出，FFA可以成功地诱导β-TC3细胞的ERS和凋亡。第二部分：库容性Ca²⁺内流参与游离脂肪酸诱发β-TC3细胞内质网应激的研究已知打破细胞内的Ca²⁺平衡能够干扰内质网的功能并诱导细胞ERS。在例如胰腺β-TC3细胞这样的非兴奋性细胞中，Ca²⁺内流是维持细胞内Ca²⁺稳态的主要机制。为了检测在β-TC3细胞中，FFA诱导的ERS是否由Ca²⁺内流变化引起，我们应用了一种Ca²⁺通道阻滞剂NiCl2来处理细胞。实验结果显示，在加入NiCl2处理细胞后，FFA并不能够增加Grp78和CHOP的表达水平（P<0.05）。这个结果能够说明FFA诱导的β细胞ERS是由Ca²⁺内流调节的。已知细胞内Ca²⁺内流的一条主要途径是通过库容性Ca²⁺通道。为了进一步证实在β-TC3细胞中，FFA诱导的ERS是否由库容性Ca²⁺内流变化引起，在FFA处理过的细胞中，我们检测了库容性Ca²⁺内流的情况。实验结果显示，FFA处理过的β-TC3细胞，其库容性Ca²⁺内流水平是BSA处理组的两倍有余（P<0.05）。近来的一些研究发现，STIM1和Orai1这两个分子与库容性Ca²⁺内流密切相关。我们通过实验发现，在FFA处理组和BSA处理组之间，STIM1和Orai1的总表达量相当（P>0.05）。然而，免疫共沉淀结果显示，在FFA处理组中，STIM1和Orai1的结合明显多于在BSA处理组中两者的结合（P<0.05）。这些结果显示，在β-TC3细胞中，FFA增强了STIM1和Orai1的结合。因此，上述结果说明FFA诱导的β细胞ERS是由库容性Ca²⁺内流的变化引起的，而库容性Ca²⁺内流是由STIM1和Orai1的结合调控的。第三部分：calpain-2参与游离脂肪酸促进β-TC3细胞CHOP表达的研究Calpain-2是一个中性的Ca²⁺依赖的蛋白酶。它介导了很多的生理性功能，例如细胞骨架重塑，细胞内囊泡运输以及细胞膜融合等。在β-TC3细胞中，为了评估FFA是否影响了calpain-2的活性，我们检测了FFA处理过的β细胞中calpain-2的活性。结果显示，FFA处理过的β-TC3细胞中的calpain-2活性与BSA处理组相比显著增强（P<0.05）。为了检测FFA诱导的β-TC3细胞ERS是否与calpain-2分子相关，我们设计了小干涉RNA（Small interfering RNA，siRNA）来下调calpain-2的表达。可以看到calpain-2的siRNA可以显著地降低其蛋白和mRNA的表达量（P<0.05）。我们还可以观察到，当β-TC3细胞接受siRNA处理后，相对于BSA处理过的细胞而言，FFA处理过的细胞中的calpain-2活性并没有显著的增加（P>0.05）。为了进一步证实calpain-2是否参与了FFA诱导的ERS，当采用calpain-2siRNA处理抑制β-TC3细胞的calpain-2活性后，我们检测了Grp78和CHOP的蛋白和mRNA表达水平。结果显示，当采用siRNA处理后，FFA能够显著地增加Grp78的蛋白和mRNA表达水平（P<0.05）。然而在相同条件下，FFA却不能够增加CHOP的蛋白和mRNA表达水平（P>0.05）。这些结果表明calpain-2参与了FFA诱导的ERS中CHOP的表达，而与Grp78的表达无关。第四部分：Calpain-2参与游离脂肪酸诱导β-TC3细胞凋亡的研究前三部分实验已经表明， FFA作用可以增加β-TC3细胞凋亡水平。为了进一步证实calpain-2分子参与了FFA诱导β细胞凋亡的过程，我们使用calpain-2的siRNA处理细胞，并运用Annexin V/PI双标染色法证实，在下调β-TC3细胞calpain-2的表达水平后，相对于BSA处理过的细胞而言，FFA处理并不能够增加凋亡细胞的百分比（P>0.05）。为了确认这些结果，我们还检测了calpase-12和caspase-3的活性水平。实验结果表明，通过calpain-2的siRNA下调β-TC3细胞calpain-2的表达水平后，相对于BSA处理过的细胞而言，FFA处理并不能够增加calpase-12和caspase-3的活性水平（P>0.05）。由以上结果可以看出，下调calpain-2表达水平可以显著减少FFA诱导的β-TC3细胞的凋亡。因此，我们得出结论：Calpain-2参与了FFA诱导的β-TC3细胞的凋亡。

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