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糖尿病并发抑郁症细胞模型的建立及中药保护作用

作　者: 尹玲桃
导　师: 王宇红
学　校: 湖南中医药大学
专　业: 中药学
关键词: DD 细胞模型海马神经细胞 NR2A NR2B 左归降糖解郁方
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：1.选择合适的葡萄糖与皮质酮干预浓度,建立DD 细胞模型,从细胞功能形态学、葡萄糖消耗量、单胺递质及神经再生相关指标等不同维度确立模型评价体系,为DD的实验研究奠定基础。2.以所建DD模型细胞为研究对象,给予中药复方左归降糖解郁方干预,明确其降糖和抗抑郁作用,并初探其治疗DD的作用机理,为DD的防治提供新思路和新方法。方法：1.DD细胞模型的建立。(1)DD细胞模型诱导剂的选择。离体培养原代海马神经元细胞7d,按诱导剂浓度不同随机分为9组。通过细胞存活率选择最佳的葡萄糖与皮质酮干预浓度组合。(2)DD细胞模型的建立。按照(1)获得的诱导剂最佳浓度组合,建立DD细胞模型。按诱导剂随机分为4组：正常组(不做任何处理)；葡萄糖组(75mM/L葡萄糖干预)；皮质酮组(100-/L皮质酮干预)；葡萄糖联合皮质酮组(75mM/L葡萄糖联合100μM/L皮质酮干预)。诱导剂干预24h后,①功能形态学评价：神经细胞鉴定, MTT测定细胞存活率,TUNEL染色测定凋亡小体；②葡萄糖消耗量：葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GOD-POD)法检测海马神经元细胞葡萄糖消耗值；③单胺递质：ELISA法测定神经递质5-HT、NE、DA;④神经再生：免疫细胞化学法检测各组海马神经元细胞神经营养因子CREB和BDNF的含量。2.左归降糖解郁方的干预作用。采用方法1确定的DD建模方法复制细胞模型,并随机分为4组：正常组,模型组,模型模型+(二甲双胍+百忧解)含药血浆组,模型+左归降糖解郁方含药血浆组。药物干预24h,各组海马神经元细胞按照方法1指标进行检测。结果：1.(1)与正常组比较,浓度组合七(75mM/L葡萄糖联合100μM/L皮质酮)在各个对应时间点细胞存活率下降显著且平稳。(2)与正常组比较,葡萄糖(75mM/L)联合皮质酮(100μM/L)干预组海马神经元细胞存活率显著下降(P<0.01)；凋亡小体数量明显增加；葡萄糖消耗值明显下降(P<0.01)；神经递质5-HT含量显著下降(P<0.01)；细胞内神经营养因子BDNF和CREB含量明显降低(P<0.05)。2.与正常组比较,模型组海马神经元细胞各项指标均出现明显异常。与模型组比较,左归降糖解郁方含药血浆组海马神经元细胞存活率在第24h后明显上升(P<0.05)；凋亡小体数量明显下降；葡萄糖消耗值在第12h后显著上升(P<0.01)；细胞内神经递质5-HT含量显著上升(P<0.01)；细胞内神经营养因BDNF子和CREB含量明显升高(P<0.05)；关键蛋白NR2A表达下降、NR2B表达明显增加(P<0.01)。结论：1.结合文献调研与实验结果,选择75mM/L葡萄糖联合100μM/L皮质酮作为最佳的葡萄糖与皮质酮浓度干预组合。2.结合DD的临床特征,采用GOD-POD法检测葡萄糖消耗量,神经递质三项,神经营养因子等5项11个指标建立一套糖尿病并发抑郁症细胞模型的评价体系。3.采用葡萄糖(75mM/L)联合皮质酮(100pM/L)干预成熟原代海马神经元24个小时的复合造模方法成功制备DD细胞模型。4.糖尿病并发抑郁症海马神经元细胞病理损伤严重,神经递质分泌紊乱,异常升高的CORT含量导致细胞病理改变,细胞内神经营养因子BDNF和CREB表达下调可能协同参与CORT损伤细胞过程,并促进了DD的发生发展。5.左归降糖解郁方可升高海马神经元细胞存活率,降低凋亡小体数量,调节葡萄糖消耗量,改善细胞神经递质分泌紊乱,增加神经营养因子蛋白表达等,其治疗作用可能与升高细胞内NR2A和NR2B表达有关,具有一定的疗效,值得进一步研究和开发。

全文目录

英文缩略词表  8-10
中文摘要  10-13
ABSTRACT  13-17
引言  17-21
第一部分糖尿病并发抑郁症细胞模型的建立  21-42
  1 实验材料  21-23
    1.1 实验动物  21
    1.2 主要实验试剂及溶液  21-22
    1.3 主要仪器  22
    1.4 主要溶液配制  22-23
  2 实验方法  23-30
    2.1 细胞培养  23-25
      2.1.1 物品准备  23-24
      2.1.2 L-多聚赖氨酸包被培养板  24
      2.1.3 取材前准备工作  24
      2.1.4 胎鼠海马组织提取、海马神经元细胞分离和培养  24-25
    2.2 DD诱导剂的选择  25
      2.2.1 实验分组  25
    2.3 DD细胞模型的建立  25-26
      2.3.1 实验分组  25-26
    2.4 指标检测  26-30
      2.4.1 原代海马神经元细胞形态与功能检测  26-28
        2.4.1.1 神经细胞形态学检查  26
        2.4.1.2 神经细胞鉴定  26-27
        2.4.1.3 MTT比色法检测神经细胞存活率  27
        2.4.1.4 HE染色  27-28
        2.4.1.5 TUNEL染色法检测神经细胞凋亡率  28
      2.4.2 葡萄糖消耗量检测  28-29
      2.4.3 神经递质检测  29
      2.4.4 CREB、BDNF含量检测  29-30
    2.5 统计学处理  30
  3 实验结果  30-37
    3.1 DD诱导剂的选择  30-32
      3.1.1 海马神经元细胞形态与功能检测  30-32
        3.1.1.1 神经元细胞形态学检查  30
        3.1.1.2 神经元细胞鉴定  30-31
        3.1.1.3 MTT法检测神经细胞存活率  31-32
    3.2 DD细胞模型的建立  32-37
      3.2.1 原代海马神经元细胞形态与功能检测  32-34
        3.2.1.1 神经细胞形态学检查  32
        3.2.1.2 神经细胞鉴定  32
        3.2.1.3 MTT法检测神经细胞存活率  32-33
        3.2.1.4 HE染色  33
        3.2.1.5 TUNEL染色  33-34
      3.2.2 葡萄糖消耗量检测  34-35
      3.2.3 神经递质DA、NE、5-HT含量检测  35-36
      3.2.4 BDNF、CREB含量检测  36-37
  4 讨论  37-42
    4.1 DD细胞建模方法的选择  37-39
    4.2 DD细胞模型评价指标的确立  39-41
      4.2.1 糖尿病样指标评价  39-40
      4.2.2 抑郁样指标评价  40-41
    4.3 DD细胞模型与单纯糖尿病细胞模型、抑郁症细胞模型的区别  41-42
第二部分左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型细胞的保护作用  42-52
  1 实验材料  42-43
    1.1 实验动物  42
    1.2 主要实验试剂及溶液  42
    1.3 主要仪器  42
    1.4 主要溶液配制  42-43
  2 实验方法  43-44
    2.1 细胞培养  43
    2.2 左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型细胞的保护作用研究  43
      2.2.1 实验分组  43
    2.3 指标检测  43
    2.4 统计学处理  43-44
  3 实验结果  44-50
    3.1 海马神经元细胞形态与功能检测  44-46
      3.1.1 神经元细胞形态学检查  44
      3.1.2 神经元细胞鉴定  44
      3.1.3 MTT法检测神经细胞存活率  44-45
      3.1.4 HE染色  45
      3.1.5 TUNEL染色  45-46
    3.2 葡萄糖消耗量检测  46-47
    3.3 神经递质DA、NE、5-HT含量检测  47-48
    3.4 BDNF、CREB含量检测  48-49
    3.5 NR2A、NR2B含量检测  49-50
  4 讨论  50-52
    4.1 左归降糖解郁方的组方原则及药物配伍意义  50-51
    4.2 左归降糖解郁方对DD模型细胞的保护作用  51-52
结论  52-53
创新点  53-54
致谢  54-56
参考文献  56-60
附录  60-69
  综述  60-68
    参考文献  65-68
  攻读硕士期间发表的论文  68-69
  攻读硕士期间参与的课题  69

糖尿病并发抑郁症细胞模型的建立及中药保护作用

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