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蛇床子素防治脂多糖诱导的急性肺损伤的作用及其机制研究

作　者: 陈向军
导　师: 李志超
学　校: 第四军医大学
专　业: 内科学
关键词: 蛇床子素 脂多糖 急性肺损伤 氧化应激 硫氧还蛋白1
分类号: R563.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景：急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是多种因素引起的，以肺部微血管和肺泡上皮弥漫性损伤、肺水肿及肺间质纤维化等为病理特征的临床综合症，严重者可发展为急性呼吸窘迫综合症（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。由于ALI/ARDS发生机制较为复杂且具有较高死亡率，目前尚无特异有效的防治方法和药物。所以研究ALI/ARDS发生机制，研究有效治疗药物是该领域的重要研究方向。蛇床子素（Osthole，Osth）具有多种生物活性，如抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗凋亡等，已经被众多学者所关注。近年来，许多文献已经报道Osth具有抗氧化和抗炎的作用，但有关Osth对脂多糖引起的ALI的保护作用及其机制研究的尚鲜见报道。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是ALI/ARDS的常见致病因素之一。大量实验证明，LPS参与激活体内的活性氧簇（reactive oxygenspecies，ROS）从而引发体内氧化应激（oxidative stress，OS）。在氧化抗氧化的系统中，核因子相关因子（Nuclearfactor erythroid-2related factor2，Nrf2）可以调节硫氧还蛋白1（thioredoxin1，Trx1）等多种抗氧化蛋白，同时Trx1起到了清除ROS及氧化还原的重要作用。有研究表明Osth具有抗氧化作用，那么Osth在LPS诱导的ALI中是否通过Nrf2和Trx1清除ROS从而发挥保护ALI的作用仍不明确。本实验拟观察Osth对LPS所致小鼠ALI的预防及其治疗作用和对细胞OS损伤的保护作用，并进一步研究其发挥作用机制。实验目的：（1）观察Osth对LPS导致小鼠死亡率的影响。（2）观察Osth对LPS诱导的ALI的防治作用。（3）观察Osth是否通过Nrf2/Trx1通路减轻ALI。实验方法：动物实验为了观察Osth对小鼠死亡率的影响，将雄性小鼠（18-23g）随机分为三组：Control组（n=20），LPS组（n=20）及Osth+LPS组（预防组，n=60）。腹腔注射50mg/kg LPS成功建立小鼠内毒素血症模型，在Osth+LPS组分别给予Osth（20，40或80mg/kg），连续三天，每天一次。然后给予腹腔内注射LPS后，每12h记录一次小鼠的死亡情况，连续72h。雄性BALB/c小鼠（18-23g）适应环境后，随机分为五组：对照组（n=10），Osth组（n=10），LPS组（n=10），Osth+LPS组（n=30），LPS+Osth组（n=30）。LPS组气管内滴注LPS建立小鼠肺损伤模型。在对照组，Osth组与Osth+LPS组，分别以生理盐水和Osth（40mg/kg）灌胃三天，每天一次。然后在LPS组，Osth+LPS组和LPS+Osth组，分别给予LPS（5mg/kg）气管内滴注。LPS+Osth组在气管内滴注LPS后1h给予灌胃Osth（40mg/kg）。在LPS处理6h后取小鼠肺组织进行检测和观察。测定肺湿重/干重比值（W/D）、肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中蛋白含量，肺组织匀浆中检测过氧化氢（hydrogenperoxide，H2O2），羟自由基（hydroxylradical， OH）和丙二醛（Methane Dicarboxylic Aldehyde，MDA）。Western blot检测Nrf2和Trx1的蛋白含量。细胞实验培养A549细胞系，在培养到对数生长期时进行传代。用Osth（0，25，50或100μg/ml）处理A549细胞，2h后部分细胞被LPS（1μg/ml）刺激12h，取细胞上清液检测LDH含量。将A549细胞接种到96孔板中，处理同上所述，然后使用MTT法检测A549细胞活力。为了证明Osth是否通过Nrf2/Trx1来清除ROS，从而发挥保护作用。将A549细胞接种于6cm细胞培养皿中，加入Nrf2siRNA和50μg/ml Osth，共同培养2h后加入1μg/ml的LPS，检测LDH和细胞活力。RT-PCR检测Nrf2和Trx1的mRNA和蛋白表达，并用流式细胞术检测细胞内ROS含量。实验结果：动物实验Osth对LPS导致的小鼠死亡率的影响：20，40或80mg/kg Osth预处理组的小鼠72h死亡率分别为：80%，45%和40%，比LPS组的累计死亡率（85%）均有降低，并且在40，80mg/kg的Osth+LPS组72h累计死亡率明显降低，具有统计学差异（P<0.05）。肺组织病理结果表明：在LPS组肺组织充血、水肿明显，有大量炎症细胞浸润，并存在大面积肺不张。而在Osth+LPS组和LPS+Osth组LPS导致的肺损伤明显减轻；LPS组W/D、BALF中蛋白含量均比对照组明显升高（P<0.05），但是在Osth+LPS组和LPS+Osth组上述两个指标均较LPS组明显降低（P<0.05）。LPS组的肺组织匀浆中H2O2， OH，MDA含量明显高于对照组（P<0.05），而在LPS+Osth组和Osth+LPS组，三者的含量明显低于LPS组有统计学差异（P<0.05）。Western Blot结果显示：LPS组的Nrf2和Trx1的蛋白含量显著低于对照组，而Osth+LPS组和LPS+Osth组中Nrf2和Trx1的蛋白含量显著高于LPS组，具有统计学差异（P<0.05）。细胞实验LPS增加A549细胞上清液中的LDH含量，而Osth可浓度依赖性的抑制LPS导致的LDH含量增加。MTT分析结果显示：单独Osth处理组对细胞活力没有影响，1μg/ml的LPS显著降低A549细胞活力，Osth浓度依赖性的减轻LPS诱导的细胞活力下降。LPS可以显著增加LDH和细胞内ROS的含量，并显著降低细胞活力。然而，Nrf2和Trx1的mRNA和蛋白含量被明显下调。给予Osth后的LPS组LDH和细胞内ROS被抑制。与此同时，细胞活力、Nrf2和Trx1的mRNA和蛋白表达均增加。Nrf2siRNA后Nrf2和Trx1的mRNA和蛋白表达降低。Nrf2siRNA+Osth+LPS组中LDH和ROS的含量比Osth+LPS组的增加，细胞活力增加。因此，Nrf2siRNA可以下调Nrf2/Trx1的表达，同时逆转Osth对细胞损伤的保护作用。结论：（1） Osth明显降低LPS导致的小鼠死亡率。（2） Osth对LPS导致的小鼠ALI具有预防和治疗作用。（3） Osth可能通过上调Nrf2和Trx1起到防治LPS诱导的ALI的作用。

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 呼吸系及胸部疾病 > 肺疾病 > 呼吸衰竭
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