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SENP-1调节低氧诱导因子-1α在低氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

作　者: 周芳
导　师: 戴爱国
学　校: 南华大学
专　业: 内科学
关键词: 低氧诱导因子-1α SUMO特异性蛋白酶1 小泛素蛋白样修饰蛋白1 肺动脉平滑肌细胞 增殖 低氧性肺动脉高压
分类号: R544.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


【目的】低氧性肺血管重塑(HPSR)在低氧性肺动脉高压(HPH)发生发展中起重要作用。介导HPSR发生的主要机制是肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖，其发病的分子学基础为HIF-1α调控的信号通路。通过检测低氧对离体培养的大鼠PASMCs增殖的影响,以及不同低氧时间处理下PASMCs中SENP-1、HIF-1α和下游应答基因VEGF的表达情况，探寻低氧下SENP-1在HIF-1α-VEGF信号通路中所起的作用以及对大鼠PASMCs增殖的影响，为HPH的治疗与预防提供新的思路。【方法】实验由四个部分组成：（1）提取大鼠PASMCs并低氧处理：组织块贴壁法分离出SD大鼠PASMCs并原代和传代培养，光镜下观察细胞的形态，α-SM-actin免疫荧光法鉴定是否为平滑肌细胞。将第3或第4代生长状态良好的细胞静置于三气培养箱中（内含1%O2、5%CO2、94%N2），低氧下暴露不同时间，并依低氧时间的长短分组。（2）低氧对大鼠PASMCs增殖的影响：取对数生长期的PASMCs经细胞周期同步化后，分别在常氧或低氧条件下培育2h、6h、12h、24h和48h，用Cell CountingKit8细胞增殖试剂盒(CCK-8)和EdU免疫荧光两种方法检测低氧对PASMCs增殖的影响。（3）低氧对大鼠PASMCs中SENP-1、HIF-1α和VEGF表达的影响：对数生长期PASMCs随机分为常氧组和低氧（2、6、12、24）h组。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹（Western blot）两种方法分别检测大鼠PASMCs中SENP-1、HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白质的表达水平。（4）构建SENP1-RNAi慢病毒载体感染PASMCs，研究此时低氧下PASMCs增殖及各因子表达情况：构建携带有siRNA的慢病毒载体，特异性沉默SENP-1基因。将生长状态一致的细胞随机分为空白对照组、空载病毒对照组和siRNA干预组，慢病毒感染后两组PASMCs，待感染效率达90%以上后，将上述各组分别在常氧或低氧下处理12h，用EdU免疫荧光法检测各组PASMCs的增殖情况。同样分组处理，RT-PCR和Western blot法分别检验SENP-1、HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白质表达水平。【结果】一、PASMCs提取与鉴定（1）选取体重约为150-180g雄性SD大鼠，无菌下取出心肺组织，分离出肺动脉中膜层并剪碎，用组织贴壁法培养，4-5天后有长梭形细胞长出，待细胞长到培养瓶的80%-90%，采用差速贴壁法提纯，后传代培养2-3代至纯度达到90%。（2）光镜下观察可见，生长状态良好的细胞形态为长梭形，呈现“峰与谷”式平滑肌细胞典型生长状态。细胞胞浆丰富，细胞核呈卵圆形位于胞质的中央。免疫荧光显微镜下观察，平滑肌特异性抗体α-SM-actin免疫荧光染色，在绿色荧光激发下细胞胞浆明显着色，而细胞核空虚未着色。以上说明提取并培养的细胞为平滑肌细胞。二、低氧对大鼠PASMCs增殖的影响（1）CCK-8检测结果示：常氧与低氧条件下，PASMCs的光密度值（OD值）均随着培养时间的递增而逐渐增加，各个时间点低氧组OD值均较相应的常氧组高。对比低氧各组OD值可见：低氧12h组开始与低氧2h、6h组之间的差异具有统计学意义（p＜0.05），低氧24h组达到顶峰值（p＜0.05），而低氧48h组OD值不再向上增加。（2）EdU免疫荧光结果示：随着低氧时间的递增，EdU标记的细胞逐渐增多。比较各组阳性细胞数和增殖细胞比率可见，低氧12h组的两项指标均明显增高，与对照组比较有统计学意义（p＜0.05），低氧24h组到达顶峰值（p＜0.05），而低氧48h组与低氧24组之间差异不大（P＞0.05）。三、低氧对大鼠PASMCs中SENP-1、HIF-1α和VEGF表达的影响（1）RT-PCR示：低氧2h组的大鼠PASMCs中SENP-1、VEGF mRNA表达即较常氧组增高（p＜0.05），随着低氧时间的延长两因子mRNA表达水平增加，低氧12h组达最高值（p＜0.05），低氧24h组较低氧12h组增加趋势不明显；缺氧能刺激HIF-1α mRNA表达，但各组间差异不大（P＞0.05）。（2）Western blot示：随着缺氧时间的延长，大鼠PASMCs中的SENP-1、HIF-1α和VEGF蛋白质表达水平均呈现增加趋势，且在低氧12h组达到最高峰（p＜0.05），低氧24h组增加趋势渐缓。四、构建siRNA特异性沉默大鼠PASMCs中的SENP-1基因，检测此时低氧对PASMCs的影响（1）EdU免疫荧光结果显示：空白对照组、空载病毒对照组、siRNA干扰组中低氧12h较常氧情况下阳性细胞数和增殖细胞比率均增高。SENP-1基因沉默组的阳性细胞数和增殖细胞比率均低于相应各组（p＜0.05）。（2）沉默SENP-1后，常氧和低氧条件下，siRNA干扰组的HIF-1α、VEGF的mRNA和蛋白水平均低于相应对照组（p＜0.05）。【结论】一、低氧可明显促进离体培养的大鼠PASMCs发生增殖，其中HIF-1α调控的信号通路是重要的分子学基础。二、SENP-1介导HIF-1α去SUMO化修饰，可增加HIF-1α的稳定性和转录活性并加强其下游靶基因VEGF的表达，进而在大鼠PASMCs的低氧性增殖中发挥重要作用。

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 血压异常 > 高血压
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