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Apelin-13通过激活PKCα上调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1的表达

作 者: 刘晓艳
导 师: 唐朝克
学 校: 南华大学
专 业: 病理学与病理生理学
关键词: 动脉粥样硬化 apelin-13 三磷酸腺苷结合盒转运体A1 蛋白激酶Cα calpain
分类号: R543.5
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


目的:Apelin家族(包括apelin-13)是孤儿G蛋白偶连受体APJ的配体,是新近发现的一种脂肪因子,具有血管保护及抗炎的作用。有研究发现PKC可能参与apelin细胞内信号的传导。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)作为一种重要的胆固醇转运体,能通过促进细胞内胆固醇流出,减少泡沫细胞形成,起到抗动脉粥样硬化的作用。但是apelin对ABCA1是否具有调节作用尚不清楚。本研究选取THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞作为研究对象,探讨apelin-13对胞内ABCA1表达及其介导的胆固醇流出的影响及其机制。方法:选取ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为主要研究对象,观察不同浓度apelin-13(0,1,10,100,1000nM)及其处理细胞不同时间(0,6,12,24,48h)后,细胞内ABCA1表达情况。油红O染色及高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量,液体闪烁计数法检测细胞内胆固醇流出情况。实时定量PCR检测ABCA1mRNA水平。Western blot检测ABCA1、PKC及磷酸化PKC蛋白水平。Calpain活性检测试剂盒检测calpain的活性。用apelin活性抑制剂PTX、PKC抑制剂或用转染PKCα siRNA对apelin-13作用下的细胞共处理24h,检测细胞内ABCA1、磷酸化ABCA1水平及calpain活性,并观察对胆固醇流出的影响。结果:Apelin-13以时间及剂量依赖性上调ABCA1的蛋白表达,但对其mRNA水平无显著影响。进一步研究发现apelin-13通过磷酸化ABCA1及抑制calpain的活性,减少ABCA1蛋白降解,从而增加细胞内胆固醇流出;用PKC抑制剂预处理或转染PKCα的小干扰RNA,apelin-13对细胞内ABCA1蛋白、ABCA1磷酸化水平及calpain活性等的影响随即取消。结论:在THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中,apelin-13通过激活PKCα抑制calpain活性,并磷酸化ABCA1,从而提高ABCA1的稳定性,减少其蛋白降解,起到上调ABCA1表达及促进细胞内胆固醇流出的作用。

全文目录


中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
引 言  8-10
实验材料  10-12
  一 主要试剂与配制  10-11
  二 主要仪器与器材  11-12
实验方法  12-16
  一 细胞培养  12
  二 低密度脂蛋白的分离 氧化修饰及鉴定  12-13
  三 油红O染色  13
  四 细胞总蛋白的提取  13
  五 实时定量 PCR  13-14
  六 Western blot  14
  七 siRNA 序列设计 载体构建及转染  14
  八 高效液相色谱法检测细胞内胆固醇 胆固醇酯  14-15
  九 胆固醇流出实验  15
  十 ABCA1 磷酸化检测  15
  十一 统计学分析  15-16
实验结果  16-28
  一 Apelin-13 能促进 THP-1 巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇的流出  16-19
  二 Apelin-13 上调 THP-1 巨噬细胞源性泡沫细胞 ABCA1 的蛋白表达,但不影响其 mRNA 表达。  19-21
  三 Apelin-13 通过抑制 calpain 的活性减少 ABCA1 的降解  21-23
  四 Apelin-13 通过激活 PKCα 增加 ABCA1 的稳定性  23-26
  五 Apelin-13能通过PKCα通路磷酸化ABCA1  26-28
讨论  28-31
结论  31-32
参考文献  32-37
附录  37-38
硕士期间发表的论文  38-39
致谢  39-40

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管(循环系)疾病 > 血管疾病 > 动脉疾病
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