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SelS对肿坏死因子-α诱导的血管钙化的影响

作　者: 卞卫霞
导　师: 刘红梅
学　校: 华中科技大学
专　业: 无机化学
关键词: 血管钙化 炎症 硒蛋白S 肿瘤坏死因子-α 血管平滑肌细胞
分类号: R543
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 3次
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内容摘要


血管钙化是动脉粥样硬化、糖尿病、慢性肾病等多种疾病的病理特征。血管钙化形成的一个中心环节就是血管平滑肌细胞(VSMCs)向成骨细胞分化。炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)能诱导VSMCs向成骨细胞分化，促进血管钙化。硒是哺乳动物所必需的一种微量元素，它在生物体中以硒蛋白的形式发挥生理作用。SelS是硒蛋白家族中的一员，已有研究表明，SelS能够参与炎症调节。我们采用-甘油磷酸钠诱导VSMCs体外钙化，初步探究了SelS、炎症、血管钙化之间的关系,取得了如下结果：1.通过RT-PCR和蛋白质印迹技术初步探索了大鼠SelS基因的有效沉默片段。经过大量的实验探索，初步的结论为：在所设计的五条siRNA片段中，编号为siRNA-148沉默效果最佳，其序列为：Sense:5’-GCGUCCUUCUCUAC AUUGUTT-3’;Antisense:5’-ACAAUGUAGAGAAGGACGCTT-3’。2.初步数据显示，SelS沉默后，钙化的VSMCs的ALP活性降低，钙化标志蛋白cbfa-1、ColI基因表达下降，但基质钙沉积增加。这些结果表明SelS可能有抑制血管钙化的作用，但其作用机理有待进一步研究。3.与先前文献报道一致，我们研究发现，TNF-α能够增强钙化VSMCs中ALP活性及cbfal的表达，表明TNF-α在体外促进VSMCs向成骨细胞分化。4.用siRNA-148片段使SelS基因沉默后，TNF-α促进VSMCs向成骨细胞分化作用减弱，表现为ALP活性及cbfal的表达均显著下降。但是，通过对基质钙含量的测定发现，SelS基因沉默使TNF-α促进钙化的能力进一步增加，表明SelS可以抑制TNF-α诱导的钙化。这只是初步结果，还需要大量的实验进一步证实。5.将钙化的VSMCs用亚硒酸钠预处理24h，再用TNF-α作用细胞。发现亚硒酸钠能够抑制TNF-α诱导的ALP活性的增强，并且100nmol/L的亚硒酸钠效果最为显著。这表明亚硒酸钠可能能够抑制TNF-α诱导的血管钙化。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-22
  1.1 本课题的研究意义  9-10
    1.1.1 本课题的研究背景  9-10
    1.1.2 选题意义  10
  1.2 血管钙化形成机制  10-15
    1.2.1 血管钙化  10-12
    1.2.2 血管钙化与炎症  12-15
  1.3 硒与硒蛋白  15-20
    1.3.1 SelS  16-18
    1.3.2 其它硒蛋白  18-20
  1.4 SIRNA 沉默技术  20-22
2 实验部分  22-36
  2.1 实验所用仪器  22
  2.2 实验所用试剂  22-23
  2.3 试剂配制方法  23-27
    2.3.1 用于细胞培养的试剂  23-25
    2.3.2 用于细胞转染的试剂配制  25
    2.3.3 碱性磷酸酶(ALP)活性的测定试剂  25-26
    2.3.4 测定蛋白质含量所用试剂  26
    2.3.5 western blot 所用试剂  26-27
  2.4 实验方法  27-36
    2.4.1 大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养及钙化模型的建立  27-28
    2.4.2 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量  28-29
    2.4.3 碱性磷酸酶活性的测定  29-30
    2.4.4 细胞内钙含量的测定  30
    2.4.5 蛋白免疫印迹  30-31
    2.4.6 SelS 的小分子 RNA 干扰(siRNA)  31-32
    2.4.7 实时荧光定量 PCR(RT-PCR)  32-35
    2.4.8 统计学方法  35-36
3 实验结果与讨论  36-49
  3.1 大鼠 SELS(SELS)基因沉默条件探索  36-39
  3.2 SELS 基因沉默对血管钙化的影响  39-42
  3.3 TNF-α对血管钙化的影响  42-43
  3.4 SELS 沉默对 TNF-α促进血管钙化作用的影响  43-46
  3.5 补硒对 TNF-α诱导的血管钙化的影响  46-49
4 总结  49-51
致谢  51-52
参考文献  52-62

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 血管疾病
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