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研究背景与目的：随着生活水平的提高,心肌梗死发生率呈逐年上升的趋势,经过不断的探索,心肌梗死的死亡率已明显下降,尤其是冠脉介入的广泛开展以后,但却引起了缺血再灌注损伤如心肌细胞死亡、血流动力学障碍、再灌注心律失常及内皮功能障碍等发生率的增加。心肌细胞遭受缺血再灌注损伤后将发生一系列病理改变,出现细胞代谢紊乱和功能障碍。首先,心肌细胞钠钾ATP酶受损,钠离子在细胞内积聚,由于渗透压的作用导致细胞外液向细胞内转移,发生细胞水肿、肿胀。病变进展将逐渐出现细胞超微结构的改变,细胞膜及细胞器膜的完整性遭到破坏,由可逆性损伤向不可逆损伤转化。心肌细胞受到缺血再灌注损伤的同时,微血管内皮细胞同样受到损伤,扩血管物质减少缩血管物质增加,血小板及白细胞吸附于血管壁导致微血管阻塞,出现微血管水平无灌注现象。根据已有的研究,目前认为缺血再灌注损伤的主要机制为细胞内产生过多的自由基和细胞内钙超载。心肌细胞缺血时,线粒体氧化磷酸化功能障碍,使得线粒体氧化磷酸化途径减弱而生成氧自由基过程加强,同时氧自由基清除剂又因缺氧而活性降低,最终产生大量活性氧自由基。除此之外,中性粒细胞的“呼吸爆炸”及经黄嘌呤氧化酶催化亦可产生氧自由基。氧自由基具有活泼的反应性,能够与膜磷脂、蛋白质、核酸等物质发生反应,导致细胞损伤。细胞缺氧导致各种离子转运泵功能障碍,细胞膜通透性增加,钙离子在细胞内聚集,细胞内钙浓度明显增加后可激活钙依赖蛋白酶、蛋白水解酶、磷脂酶等酶类,并可沉积于线粒体,加重细胞损伤。缺血后适应,即在心肌缺血再灌注的即刻对冠脉进行短暂、重复的开通及再闭过程,随后恢复冠状动脉血流。研究表明,缺血后适应可保护缺血再灌注损伤的心肌,在提高心肌细胞存活率、减少心肌细胞凋亡、降低心肌梗死面积[2-3]和改善内皮细胞功能等方面起到一定的保护作用。进一步研究发现,缺血后适应可保护血管内皮细胞稳定、抑制再灌注心肌细胞氧自由基的产生、减少中性粒细胞的激活及聚集,减少微血管的病变,影响缺血再灌注损伤的各个环节,减少心肌细胞损伤。缺血后适应主要应用在急性心肌梗死的PCI治疗中,操作方法简便,在临床应用以来,表现出了较好的临床效果。Garcia等[4]发现经过后适应治疗能够明显降低心肌梗死后CK的峰值及CK-MB的比例,减少患者心肌梗死面积。缺血后适应在基础及临床都显示出较好的心肌保护作用,临床证实具有一定的可行性、安全性及潜在作用。心肌营养素-1(Cardiotrophin-1, CT-1)是由Pennica[18]在1995年从小鼠胚胎干细胞培养液中分离出来的,被分类于白介素-6(IL-6)及白血病抑制因子(LIF)细胞因子家族,化学结构与白介素-6家族相似并且可以与gp130受体结合。在早期,CT-1只是作为心肌疾病诊断和判断预后的标志物,最近的研究发现在心肌损伤中它是一种重要的神经激素,主要表达于心肌细胞和心肌成纤维细胞,骨骼肌、肝脏和神经节等多种分化组织中亦有表达,可参与心脏生理调节过程,具有促进细胞存活和心脏正常发育的作用。在大鼠的动物实验中,心室肥厚的早期阶段即出现CT-1mRNA表达增加,而且心肌肥厚后CT-1一直保持高水平表达。Lopez B[6]等通过研究发现,血浆CT-1水平与心力衰竭程度、左心室质量指数呈正相关,与射血分数呈负相关,而且这些相关性独立于很多错综复杂的潜在影响因素,提示CT-1可作为评估心衰程度的指标,进一步的研究表明CT-1较N末端脑钠肽原对C期心力衰竭患者的诊断灵敏度更高,测量血浆CT-1浓度可对C期心力衰竭患者提供额外的信息。以上的研究表明CT-1与心室重构密切相关,而Jin等发现CT-1还对血流动力学有一定影响。静脉注射CT-1后大鼠会发生全身性低血压,其机制为降低外周血管阻力,并且这种降血压效应呈剂量依赖性；CT-1降压的同时可增加心排血量,改善心功能。实验已经证明,CT-1在心肌梗死后的缺血心肌中表达明显增加,提示CT-1具有抗心肌细胞死亡,促进残存心肌细胞存活及加快梗死区愈合的作用。基础研究发现CT-1能促进新生大鼠心肌细胞在无血清培养基中存活,以上均表明CT-1对心肌细胞缺血缺氧具有保护作用。心肌细胞遭受再灌注损伤后,线粒体通透性转换通道(mitochondriai permeabiiity transition pore, mPTP)通透性增高,促凋亡蛋白由线粒体释放到细胞浆中,导致细胞死亡一一凋亡或坏死。后适应可激活ERK1/2通路,使其下游的GSK-3β磷酸化而失去活性,提示ERK1/2信号通路的激活可抑制mPTP的开放,减少细胞凋亡及坏死。ERK1/2信号通路的激活还可抑制BAD活性或促进蛋白转录而发挥保护作用。CT-1具有心肌保护作用,但其具体的作用机制以及信号转导途径尚需进一步的研究来证实。本研究以H9C2心肌细胞株为实验对象,在离体情况下,以缺氧复氧模型模拟缺血再灌注损伤,以缺氧后适应模型模拟缺血后适应,将缺氧后适应与CT-1两种细胞保护措施联合,通过观察心肌细胞存活率、凋亡率、Bad mRNA表达量及磷酸化ERK1/2蛋白(p-ERK1/2蛋白)表达的变化,了解在缺氧后适应的基础上联合CT-1后对缺氧复氧心肌细胞的保护作用。并应用信号通路阻断剂,阻断信号传导,进一步阐明CT-1和缺氧后适应对缺氧复氧心肌保护作用的机制及信号转导途径,从微观水平论述CT-1和缺氧后适应如何通过信号通路激活保护心肌细胞免受缺氧复氧损伤。材料：离体培养H9C2,心肌细胞株,H9C2心肌细胞株在含10%胎牛血清的DMEM-高糖培养基和37℉和5%CO2的培养箱中进行培养,复苏细胞正常传2、3代后,取指数生长期的细胞进行实验。方法：将细胞分为6组,分别给予不同的处理。a.正常对照组：细胞用含10%新生牛血清的DMEM液正常培养,不经任何处理。b.缺氧复氧组：缺氧,用pH6.8D-Hanks液在缺氧培养箱(95%N2,5%C02,37℃)培养3h；复氧,缺氧3h之后用把pH6.8D-Hanks换成含10%新生牛血清DMEM液,在MCO-17AIC02培养箱(95%02,5%CO2,37℃)复氧3h。c.缺氧复氧+缺氧后适应组：同(2)组,在复氧之前施加5min复氧/5min缺氧3个循环。d.缺氧复氧+缺氧后适应+CT-1组：同缺氧复氧组,在缺氧3h后加入10ug/1心肌营养素-1,再施加5min复氧/5min缺氧3个循环,复氧3h。e.缺氧复氧+缺氧后适应+CT-1+ERK抑制剂组：在缺氧完成前30min加入20umol/1ERK抑制剂A6355,缺氧完成后加入10ug/1心肌营养素-1,再施加5min复氧/5min缺氧3个循坏,复氧3h。f.缺氧复氧+缺氧后适应+CT-1+二甲基亚砜组：ERK抑制剂换为二甲基亚砜,其他同(e)。应用MTS法检测各组细胞存活率,以流式细胞仪检测及细胞凋亡率,采用Western Blot检测细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2和p-ERK1/2)的表达,Q-PCR技术检测Bad mRNA的表达。结果：与对照组相比,缺氧复氧组、缺氧复氧+缺氧后适应组、缺氧复氧+缺氧后适应+CT-1组、缺氧复氧+缺氧后适应+CT-1+ERK抑制剂组、缺氧复氧+缺氧后适应+CT-1+二甲基亚砜组的细胞存活率下降、凋亡率升高、Bad mRNA表达量增加,P<0.05,差异均有统计学意义。经过缺氧后适应处理后,较缺氧复氧组细胞存活率上升、凋亡率下降、p-ERK1/2蛋白表达量增加、Bad mRNA表达量减少,P<0.05,差异具有统计学意义。在缺氧后适应处理基础上加入心肌营养素-1(CT-1)后,细胞存活率上升、凋亡率下降、p-ERK1/2蛋白表达量增加、Bad mRNA表达量减少,P<0.05,差异具有统计学意义。在缺氧复氧+缺氧后适应+CT-1组中加入ERK抑制剂后,细胞存活率下降、凋亡率升高、p-ERK1/2蛋白表达量减少、Bad mRNA表达量增加,P<0.05,差异具有统计学意义。由于ERK抑制剂由二甲基亚砜溶解,而二甲基亚砜本身具有一定细胞毒性,将ERK抑制剂换为二甲基亚砜,与缺氧复氧+缺氧后适应+CT-1组相比,细胞存活率、凋亡率、p-ERK1/2蛋白表达量、Bad mRNA表达量无明显变化,P>0.05。各组细胞ERK1/2表达量未见明显差异,P>0.05。结论：缺氧复氧可明显损伤心肌细胞,缺氧后适应处理可减少心肌细胞的缺氧复氧损伤,联合CT-1后心肌细胞保护租用明显增强,其机制之一可能为激活ERK1/2信号通路,使ERK1/2蛋白磷酸化,进而下调Bad mRNA的表达,减少心肌细胞损伤。
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