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pVAX1/SjscFv-IL18对日本血吸虫病肝纤维化的影响及其作用机制的研究

作　者: 田智
导　师: 汪世平
学　校: 中南大学
专　业: 病原生物学
关键词: 日本血吸虫 肝纤维化 白介素18 单链抗体 治疗性疫苗
分类号: R532.21
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


研究背景血吸虫病(schistosomiasis)是一种流行广泛、严重危害人类健康和社会经济发展的人兽共患寄生虫病,我国是日本血吸虫病(schistosomiasis japonica)流行最严重的四个国家之一。日本血吸虫(Schistosoma japonicum, Sj)致病的主要原因是雌虫产出的大量虫卵沉积于肝、肠等组织中,形成虫卵肉芽肿、组织损伤和继发性肝纤维化。肝纤维化的进一步发展导致肝硬化,患者可因上消化道出血、肝性昏迷等严重并发症而致死。因此,阻止虫卵肉芽肿病变的形成,对于控制日本血吸虫病的进程、防止晚期血吸虫病的发生具有重要的意义。目前,临床上采用单一的吡喹酮治疗血吸虫病仍存在一定缺陷,吡喹酮只能杀灭童虫和成虫,而不能阻止肝组织内的虫卵继续分泌抗原,虫卵可溶性抗原(soluble matured egg antigen, SEA)可引起组织内虫卵肉芽肿反应,由于血吸虫病患者发现时多己转为慢性,肝组织内虫卵已经或正在形成虫卵肉芽肿或肝纤维化,有效杀虫治疗后病人依然有转化为晚期的可能,SEA诱导产生的免疫病理反应并不因杀虫治疗而终止。IL-18是目前己知的对血吸虫病肝纤维化具有治疗作用的细胞因子,然而单纯使用细胞因子治疗需连续、大剂量的用药,势必导致毒副作用的增加以及宿主体内细胞因子的严重失衡。因此,我们拟利用实验室前期筛选得到的对日本血吸虫雌虫、未成熟虫卵、成熟虫卵等多个阶段均具有高特异性免疫靶向作用及识别能力的单链抗体(Sj single-chain Fv antibody, SjscFv),将其与对血吸虫性肝纤维化具有治疗作用的细胞因子IL-18融合表达,产生SjscFv-IL18融合蛋白,借助SjscFv的免疫及靶向作用携带IL-18进入虫卵肉芽肿和肝纤维化形成的局部,特异性提高局部免疫作用及IL-18浓度,诱导日本血吸虫感染慢性期从Th2型免疫应答转化为Th1型优势的免疫应答,同时能够极大地降低IL-18对其它正常组织器官的毒副作用,以期达到更好的抗日本血吸虫性病纤维化的效果。研究目的构建真核重组质粒pVAX1/SjscFv-IL18,转染巨噬细胞后,使用SEA刺激后的巨噬细胞上清液处理肝星状细胞(HSCs),观察对HSCs激活、增殖和凋亡的影响,并检测HSCs中与细胞外基质(ECM)沉积相关的基因表达,评估其抗肝纤维化的能力；并在日本血吸虫病肝纤维化小鼠中研究其对虫卵肉芽肿及肝纤维化形成的影响及其作用机制。研究方法1、真核重组质粒pVAX1/SjscFv-IL18的构建；采用SOE-PCR技术构建重组质粒pVAX1/SjscFv-IL18和pVAX1/S/scFv,转化大肠杆菌后,进行大量表达,并通过双酶切和测序鉴定,使用生物信息学方法分析其结构特征。2、pVAX1/SjscFv-IL18对HSCs胶原生成与降解的影响将各组重组真核质粒转染巨噬细胞后,采用SEA刺激巨噬细胞后的上清液处理HSCs,应用实时荧光定量PCR(qPCR)检测胶原相关基因mRNA水平、MTT检测HSCs细胞增殖、流式细胞术检测HSCs凋亡。3、pVAX1/SjscFv-IL18对日本血吸虫病肝纤维化的影响建立日本血吸虫病肝纤维化小鼠模型,将pVAX1/SjscFv-IL18注入小鼠体内,采用]HE、Masson染色方法分别检测肝组织内虫卵肉芽肿的大小、肝组织内胶原沉积的情况,应用ELISA检测小鼠Thl/Th2型细胞因子、IL-18,免疫组化检测肝组织中TGF β1和IL-18, qPCR检测肝脏中胶原相关基因mRNA水平。研究结果1、PCR、双酶切及测序结果显示重组质粒插入序列与目的序列一致,CD-Search证实所构建质粒表达蛋白中包含目的蛋白所需的两个Ig超家族和IL-1超家族保守结构域,说明真核重组质粒pVAX1/SjscFv-IL18构建成功。2. pVAX1/SjscFv-IL18转染巨噬细胞后,采用SEA刺激该巨噬细胞产生的上清液处理HSCs,与对照组相比,能够部分降低HSCs中a-SMA的mRNA水平,并抑制HSCs增殖、促进HSCs凋亡,上调MMPs-1的同时下调Col Ⅰ、Col Ⅲ和TIMP-1的mRNA表达。3、pVAX1/SjscFv-IL18注入日本血吸虫病肝纤维化小鼠后,能够降低肝组织内虫卵肉芽肿的大小,减少肝组织内胶原的沉积,并在体内表达大量的IL18,诱导Thl型优势的免疫反应,减少肝脏中TGF β1表达,上调MMPs-1的同时下调Col Ⅰ、Col Ⅲ和TIMP-1的mRNA表达,且能够在虫卵肉芽肿局部提高IL-18的浓度,从而产生更好的抗日本血吸虫病肝纤维化的作用。结论1、成功构建了真核重组质粒pVAX1/SjscFv-IL18。2、pVAX1/SjscFv-IL18在体外能够通过影响巨噬细胞内细胞因子的分泌进而抑制HSCs中胶原的生成,促进胶原降解。3、pVAX1/SjscFv-IL18能够通过SjscFv的免疫靶向作用提高IL-18的生物学活性,从而抑制虫卵肉芽肿的形成,并产生更好的抗日本血吸虫病肝纤维化的作用。

全文目录


摘要  4-8
ABSTRACT  8-12
目录  12-14
英文缩略词表  14-17
前言  17-22
技术路线  22-25
第一章 pVAX1/SjscFv-IL18真核质粒的构建、表达、鉴定及提取  25-45
  1.1 材料  25-29
    1.1.1 质粒、菌株  25
    1.1.2 试剂  25-26
    1.1.3 引物  26-27
    1.1.4 主要仪器  27-29
  1.2 方法  29-35
    1.2.1 SOE-PCR扩增SjscFv-IL18基因  29-32
    1.2.2 pVAX1/SjscFv-IL18的构建和鉴定  32-34
    1.2.3 SjscFv-IL18基因的生物信息学分析  34-35
  1.3 结果  35-42
  1.4 讨论  42-45
第二章 pVAX1/SjscFv-IL18对HSCs胶原生成与降解的影响  45-67
  2.1 材料  45-47
    2.1.1 细胞系  45
    2.1.2 试剂  45-46
    2.1.3 引物  46
    2.1.4 主要仪器  46-47
  2.2 方法  47-53
    2.2.1 SEA的制备及浓度测定  47
    2.2.2 巨噬细胞的分化  47
    2.2.3 刺激巨噬细胞分泌TGF β1的SEA浓度的确定  47-48
    2.2.4 重组质粒DNA转染巨噬细胞  48
    2.2.5 qPCR检测HSCs中目的基因mRNA的表达  48-51
    2.2.6 MTT检测HSCs细胞增殖  51
    2.2.7 流式细胞仪分析HSCs细胞凋亡率  51-52
    2.2.8 统计学分析  52-53
  2.3 结果  53-64
    2.3.1 SEA蛋白的浓度测定  53
    2.3.2 巨噬细胞的分化和最适SEA刺激浓度的确定  53-55
    2.3.3 重组质粒转染后能诱导巨噬细胞高表达IFN-γ  55-56
    2.3.4 真核重组质粒对HSCs活化的影响  56-57
    2.3.5 MTT检测HSCs细胞增殖  57-58
    2.3.6 流式细胞仪检测HSCs细胞凋亡  58-60
    2.3.7 真核重组质粒转染巨噬细胞对HSCs胶原生成的影响  60-61
    2.3.8 真核重组质粒对HSCs胶原降解的影响  61-64
  2.4 讨论  64-67
    2.4.1 SEA能够直接刺激巨噬细胞分泌TGF β1  64
    2.4.2 重组质粒对HSCs激活的影响  64-65
    2.4.3 重组质粒转染巨噬细胞对HSCs增殖和凋亡的影响  65
    2.4.4 重组质粒对HSCs中胶原相关基因表达的影响  65-67
第三章 pVAX1/SjscFv-IL18对日本血吸虫病肝纤维化的影响  67-93
  3.1 材料  67-69
    3.1.1 实验动物和阳性钉螺  67
    3.1.2 试剂  67-68
    3.1.3 引物  68
    3.1.4 主要仪器  68-69
  3.2 方法  69-73
    3.2.1 pVAX1/SjscFv-IL18在小鼠体内的表达  69
    3.2.2 日本血吸虫病肝纤维化动物模型的建立  69
    3.2.3 不同时间点注射重组真核质粒  69-70
    3.2.4 血清的分离和肝组织匀浆的制备  70
    3.2.5 血清中Th1/Th2型细胞因子检测  70
    3.2.6 肝脏组织病理学分析  70
    3.2.7 qPCR鉴定肝组织中与胶原相关的基因mRNA表达  70-71
    3.2.8 ELISA分析IL-18在体内的分布  71
    3.2.9 免疫组化分析IL-18在肝组织切片中的分布  71-72
    3.2.10 统计学分析  72-73
  3.3 结果  73-88
    3.3.1 pVAX1/SjscFv-IL18能在体内诱导IL-18高表达  73
    3.3.2 pVAX1/SjscFv-IL18对肝纤维化的治疗作用  73-80
    3.3.3 pVAX1/SjscFv-IL18能在体内诱导Th1型优势免疫应答  80
    3.3.4 IHC检测各组小鼠肝脏中的TGFβ1  80-81
    3.3.5 qPCR检测肝组织中与胶原相关的基因mRNA表达  81-85
    3.3.6 IL-18在日本血吸虫感染鼠的血清和肝匀浆中的差异性分布  85-86
    3.3.7 IHC检测IL-18在肉芽肿局部的分布  86-88
  3.4 讨论  88-93
    3.4.1 pVAX1/SjscFv-IL18诱导Th1型优势免疫反应  88-89
    3.4.2 早期给予pVAX1/SjscFv-IL18治疗具有更好的抗纤维化效果  89-90
    3.4.3 pVAX1/SjscFv-IL18降低肝组织中TGF β1蛋白含量  90
    3.4.4 pVAX1/SjscFv-IL18能调节胶原相关基因的mRNA水平  90-91
    3.4.5 pVAX1/SjscFv-IL18的特异性靶向作用  91-93
参考文献  93-106
综述一  106-116
  参考文献  112-116
综述二  116-126
  参考文献  123-126
致谢  126-127
攻读学位期间主要研究成果  127-128

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 寄生虫病 > 蠕虫病 > 吸虫病 > 血吸虫病
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