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基于主客体作用的细胞内核酸链光控释放的研究
作 者: 聂钰洪
导 师: 杨荣华
学 校: 湖南大学
专 业: 分析化学
关键词: 基因沉默 金纳米颗粒 环糊精 偶氮苯 二茂铁 核酸三链
分类号:
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
基因治疗在生物医学和生物有机学领域有着广阔的前景,基因沉默也有着重要的生物学意义。基因治疗领域的关键问题就是如何将外源核酸成功引入细胞以及在细胞内如何可控、高效的释放。目前,利用纳米材料作为负载体,运载外源核酸进入细胞已经获得了很大的成功。本文主要研究了通过纳米颗粒负载外源核酸进入细胞后,外源核酸链如何在细胞内可控、高效释放的方法。本文首先研究了基于环糊精和偶氮苯的主客体相互作用实现体外光调控细胞基因沉默。将巯基化的环糊精修饰在金纳米颗粒表面,在目标核酸链上标记偶氮苯分子。在可见光照射下偶氮苯为反式构型,可以进入环糊精分子空腔,形成负载核酸链的金纳米颗粒。利用金纳米颗粒的生物相容性将核酸链负载进入细胞。通过紫外光的照射使偶氮苯的构型发生变化,脱离环糊精分子的空腔,实现目标链的可控释放,达到抑制绿色荧光蛋白表达的目的。其次,分析研究了基于二茂铁的协同竞争作用实现体外光调控目标核酸链在细胞中的快速释放。二茂铁分子与环糊精的结合常数比偶氮苯与环糊精的结合常数高一个数量级,因此在有二茂铁分子存在的条件下,二茂铁与环糊精的强结合力促进偶氮苯分子从环糊精中的释放。当光照与二茂铁同时存在时,外源核酸会在进入细胞后快速的释放,缩短光照时间。最后,研究了基于核酸三链结构的银离子表面增强拉曼检测。核酸单链能很好的稳定金纳米颗粒,核酸三链对金纳米颗粒的稳定性不强。银离子能与两个胞嘧啶作用形成配合物。溶液中没有银离子时,单链和双链能很好的稳定金纳米颗粒。当加入银离子后,单链通过银离子的作用与双链结合形成三链结构,在高盐浓度下,金纳米颗粒会发生团聚。金纳米颗粒表面吸附有罗丹明分子(R6G),当其团聚时会产生“热点”,可以通过拉曼信号进行银离子的检测。
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全文目录
摘要 5-6 Abstract 6-11 本文所用英文缩略词表 11-12 第1章 绪论 12-29 1.1 环糊精与偶氮苯的主客体相互作用 12-18 1.1.1 环糊精的结构和性质 12-13 1.1.2 偶氮苯的结构和性质 13-15 1.1.3 环糊精和偶氮苯的相互作用的应用 15-18 1.2 核苷酸功能化的金纳米颗粒的性质和生物应用 18-25 1.2.1 纳米材料 18-20 1.2.2 金纳米颗粒的性质 20 1.2.3 核苷酸功能化的金纳米颗粒的合成 20-21 1.2.4 核苷酸功能化的金纳米颗粒的性质 21-22 1.2.5 核苷酸功能化的金纳米颗粒的生物相容性 22-23 1.2.6 核苷酸功能化的金纳米颗粒在细胞中的应用 23-25 1.3 基于双链 RNA 干扰的基因沉默 25-27 1.3.1 双链 RNA 干扰基因沉默的作用机制 25-27 1.3.2 双链 RNA 干扰的特点 27 1.3.3 双链 RNA 干扰的优点 27 1.4 本文选题依据及研究内容 27-29 第2章 基于环糊精和偶氮苯的主客体相互作用研究体外光调控细胞基因沉默 29-45 2.1 前言 29-30 2.2 实验部分 30-32 2.2.1 实验试剂 30 2.2.2 实验仪器 30-31 2.2.3 粒径 13nm 的金纳米颗粒的制备 31 2.2.4 巯基化-β-环糊精修饰的金纳米颗粒的制备及表面覆盖率的测定 31 2.2.5 环糊精修饰的金纳米颗粒对目标 DNA 的负载与释放 31-32 2.3 结果和讨论 32-44 2.3.1 实验设计机理 32-34 2.3.2 巯基化-β-环糊精修饰的金纳米颗粒的表征 34-37 2.3.3 巯基化-β-环糊精修饰的金纳米颗粒的表面覆盖率 37-38 2.3.4 光调控目标 DNA 链释放的实验条件优化 38-40 2.3.5 光调控目标 DNA 链的细胞外释放 40-41 2.3.6 光调控目标 DNA 链的细胞内释放 41-43 2.3.7 光调控细胞内基因沉默 43-44 2.4 本章小结 44-45 第3章 基于二茂铁的协同竞争作用研究目标核酸链在细胞中的快速释放 45-56 3.1 前言 45-46 3.2 实验部分 46-47 3.2.1 实验试剂 46 3.2.2 实验仪器 46 3.2.3 粒径 13nm 的金纳米颗粒的制备 46-47 3.2.4 巯基化-β-环糊精修饰的金纳米颗粒的制备 47 3.2.5 在二茂铁分子的协同作用下释放目标 DNA 链 47 3.3 结果和讨论 47-55 3.3.1 实验设计机理 47-49 3.3.2 二茂铁分子竞争协同作用的可行性分析 49-50 3.3.3 二茂铁分子浓度的优化 50-51 3.3.4 二茂铁分子的协同释放作用 51-53 3.3.5 二茂铁协同释放体系的细胞毒性考察 53-55 3.3.6 二茂铁分子的协同释放作用在细胞内的应用 55 3.4 本章小结 55-56 第4章 基于核酸三链的银离子表面增强拉曼检测 56-64 4.1 前言 56-57 4.2 实验部分 57-58 4.2.1 实验试剂 57 4.2.2 实验仪器 57-58 4.2.3 粒径 30nm 的金纳米颗粒的制备和表征 58 4.2.4 银离子拉曼检测的实验步骤 58 4.3 结果和讨论 58-63 4.3.1 实验设计机理 58-59 4.3.2 三链 DNA 对金纳米颗粒稳定性的影响 59-60 4.3.3 DNA 浓度对金纳米颗粒稳定性的影响 60-61 4.3.4 银离子检测响应时间考察 61-62 4.3.5 银离子的表面增强拉曼检测 62-63 4.4 本章小结 63-64 结论与展望 64-66 参考文献 66-76 附录 攻读学位期间所发表的学术论文 76-77 致谢 77
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