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大肠杆菌O157:H7毒力蛋白NleB1,NleB2对NF-κB信号通路的影响

作　者: 陈欣欣
导　师: 梁龙
学　校: 安徽大学
专　业: 微生物学
关键词: 肠出血性大肠杆菌 O157:H7 Ⅲ型分泌系统 NleB基因敲除 NF-κB
分类号: R378.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

肠出血性大肠杆菌0157：H7是一种危害严重的肠道致病菌,0157：H7属于胞外菌,主要利用Ⅲ型分泌系统(T3SS)将毒力蛋白直接注入宿主细胞内,通过影响宿主细胞的各项生理功能,如改变细胞代谢情况、调节免疫应答、影响细胞内信号通路等,从而达到侵染宿主的目的。目前,利用生物信息学的方法分析EHEC O157:H7存在62个毒力蛋白,经实验验证的有39个,其中NleE, NleC,N1eH等毒力蛋白的致病机制研究的比较透彻,它们分别通过在不同程度上影响宿主体内的NF-κB、MAPK、泛素、细胞凋亡等信号通路,从而产生致病性,然而对于EHEC O157:H7毒力蛋白NleB的研究还处于初始阶段,研究其致病机制对于探索O157：H7的致病性具有深远意义。肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7的毒力蛋白NleB存在两个家族成员：NleB1、NleB2(其中NleB1是经实验验证的毒力蛋白,NleB2未经实验验证),而且经实验证实都是可以转录和表达的。与EHEC亲缘关系相近的肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli; EPEC)和柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)只含有一个NleB毒力蛋白,C. rodentium的毒力蛋白NleB具有N-乙酰葡糖胺转移酶活性,它可以对GAPDH进行0连接的N乙酰葡糖胺糖基化修饰,从而破坏了GAPDH与TRAF2的相互作用,进而抑制了TRAF2的多聚泛素化和NF-κB的活性。经基因序列比对,发现肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7的毒力蛋白NleB1与柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)的NleB碱基序列相似度为89%,这为我们进一步探讨O157：H7的毒力蛋白NleB1、NleB2对NF-κB信号通路的作用及作用机制奠定了基础。利用Real-time PCR方法对nleB1和nleB2转录水平评价分析,证明了nleB1和nleB2在天然菌株中都可以转录,且NleB2的表达量是NleB1的约0.0076倍,差异显著。为了进一步深入探讨EHEC O157:H7毒力蛋白NleB的功能和致病机制,我们利用λRed重组法构建了nleB1, nleB2基因敲除株。毒力评价分析得出：敲除株与野生株相比,在LB培养基中的生长速度无显著变化,在DMEM培养基中生长速度要快；基因敲除前后对HeLa粘附细胞数目无显著的影响；利用野生株和敲除株侵染HeLα细胞,用TNF-α刺激,ELISA检测IL-8的水平,发现敲除后IL-8的表达水平上调。通过构建pAcGFP-nleBl, pAcGFP-nleB2,检测nleBl, nleB2对NF-κB信号通路的影响,发现nleBl, nleB2均可以抑制TNF-α激活的NF-κB信号通路,但是对IL-1p激活的NF-κB信号通路无抑制作用。本研究构建了nleB1, nleB2基因敲除株,并对其进行了初步的毒力评价分析,通过双荧光检测系统证明了nleB1, nleB2对TNF-α激活的NF-κB信号通路有抑制作用,但是对IL-1β激活的NF-κB信号通路无抑制作用。以上实验为下一步研究NleB1、 NleB2蛋白的功能,以及阐明肠出血性大肠杆菌O157：H7的致病机制奠定了基础。

大肠杆菌O157:H7毒力蛋白NleB1,NleB2对NF-κB信号通路的影响

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