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脊柱结核分枝杆菌链霉素耐药株筛选及其耐药机制初步探讨

作　者: 李恒德
导　师: 王麓山
学　校: 南华大学
专　业: 脊柱外科
关键词: 结核耐药机制 脊柱结核 耐药基因 耐药结核 基因突变
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：探讨脊柱结核分枝杆菌链霉素耐药基因rpsL、gidB、rrs的突变及其新的耐药机制。为下一步深入探索脊柱结核新的耐药机制研究提供基础，为抗脊柱结核药物的研发提供科学的理论和实验依据，提出新的治疗策略和思路。最终遏制脊柱结核及肺结核在世界的传播及恶化。材料与方法：选取2012年09月至2013年02月在我院收治的19例脊柱结核患者。术中显露结核病灶后，收取干酪样坏死物、死骨等病变组织，用标本袋密封后送检培养。1. BACTECTMMGITTM960全自动分枝杆菌快速培养仪进行结核菌培养（其内增加MGIT PANTA抑菌剂抑制污染及杂菌）及绝对浓度法药敏试验：经常规处理临床标本后，接种至MGIT培养管，置于BACTECTMMGITTM960全自动分枝杆菌快速培养仪进行培养；培养出阳性结果后进行绝对浓度法药敏试验(包含异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素)，同时进行传统菌种鉴定。2.目的基因提取（rpsL、gidB、rrs）、电泳检测及DNA测序：培养所获得菌落经常规前处理后，经基因组提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、分离获得目的DNA、最后进行DNA测序。将测序所得结果与H37Rv DNA（来自Gene bank）做对比研究。分析基因突变位点与耐药的相关性。结果：1. BACTECTMMGITTM960全自动分枝杆菌快速培养仪培养及绝对浓度法药物敏感试验：1.1BACTECTMMGITTM960全自动分枝杆菌快速培养仪培养结果：共培养标本19例，培养阳性16例，阴性3例。阳性率为84.2%。1.2绝对浓度法药敏试验结果共16例阳性菌株进行药敏试验，存在耐药的有3例，耐药率为18.7%(3/16)。1.3菌种鉴定结果共16例标本培养结果为阳性，以TCH(噻吩-2-羧酸肼)、对PNB(对硝基苯甲酸)和L-J(改良罗氏培养基)做菌种鉴定。鉴定结果：16例均鉴定为MTB，且均为人型。2.基因芯片菌种鉴定及DNA测序2.1基因芯片分枝杆菌菌种鉴定结果BACTECTMMGITTM960全自动分枝杆菌快速培养仪培养的16例阳性菌株均进行基因芯片菌种鉴定，鉴定结果均为人型，BACTECTMMGITTM960系统培养结果与基因芯片菌种鉴定的结果全数符合；2.2DNA测序结果A、B、C耐药菌株在gidB基因测序中，均发现了新突变位点，A菌株：第615（205丙氨酸—>丙氨酸）、299（100丝氨酸—>苯丙氨酸）、276（92谷氨酸—>天门冬氨酸）有突变，其中615为新的突变位点。B菌株：第615（205丙氨酸—>丙氨酸）、299（100丝氨酸—>苯丙氨酸）、276（92谷氨酸—>天门冬氨酸）有突变，224移码（670C缺失），其中615、670为新的突变位点。C菌株：在第615（205丙氨酸—>丙氨酸）、299（100丝氨酸—>苯丙氨酸）、276（92谷氨酸—>天门冬氨酸）、102（34甘氨酸—>甘氨酸）有突变，其中205、34为新的突变位点。在rpsL基因上A、B、C三菌株在363（121赖氨酸—>赖氨酸）均有同义突变；而在rrs基因上均未发现突变。结论：1、本实验在脊柱结核杆菌链霉素耐药株gidB基因中发现了新的突变位点：C102T、T615C、224移码（670C缺失）。2、初步得出在rrs、rpsL基因未发生突变及gidB基因C102T、T615C均为同义突变的情况下，T276G、G299A双位点的突变可能导致脊柱结核杆菌SM高耐药水平，而224移码（670C缺失）也可能为其中原因之一。

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