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人ATP2A3基因慢病毒shRNA载体质粒的构建及鉴定

作　者: 陈远
导　师: 王毅
学　校: 南华大学
专　业: 外科学
关键词: ATP2A3 RNA干扰慢病毒质粒构建盐霉素
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的构建人ATP2A3基因慢病毒shRNA载体并进行鉴定，为进一步探讨盐霉素通过调控ATP2A3基因抗肿瘤干细胞的机理研究提供实验材料。方法1.构建4条ATP2A3基因慢病毒shRNA载体：将目的基因干扰序列连接到pGMLV-SC1RNA干扰慢病毒载体后将其转进细菌感受态细胞中，等生成单克隆菌落后行PCR测序鉴定，测序比对正确的克隆即为所需的ATP2A3基因RNAi慢病毒载体。2.包装慢病毒及测定病毒滴度：抽提高纯度、无内毒素的慢病毒shRNA载体及其辅助包装原件载体质粒，使用HG transgene reagent将两者共转染到293T细胞，通过促转染、换液、培养等处理后，获取细胞上清液，进一步经浓缩后获得高滴度慢病毒浓缩液，在293T细胞中标定其病毒滴度。3.干扰载体对PC-3细胞内ATP2A3的沉默评价：用包装好的慢病毒以及慢病毒阴性对照感染靶细胞PC-3，感染成功后通过Western Blot和RT-PCR方法评价干扰载体对靶基因的干扰效果。结果1.对构建好的4条慢病毒干扰载体经PCR测序鉴定，DNA序列均无位点突变，证明质粒构建成功。2.将构建好的慢病毒载体质粒阳性克隆菌株转染293T细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光；在293T细胞中进行病毒包装，最终纯化出pGMLV-SC1-ATP2A3慢病毒颗粒，并测得其滴度为1*109TU/ml。3.病毒感染靶细胞后，经Western blot及RT-PCR验证，4条shRNA均有一定的沉默，其中以ATP2A3-shRNA4最明显。结论1.通过RNA干扰技术，成功构建了人ATP2A3基因慢病毒shRNA载体。2.构建的干扰载体能够顺利的进行慢病毒的包装，并获得较高的病毒滴度。3.RT-PCR及Western blot检测结果表明，ATP2A3-shRNA4为ATP2A3四个靶点中沉默效果最佳者，由其感染的PC-3细胞株为探讨盐霉素通过调控ATP2A3抗肿瘤干细胞机理研究提供了实验材料。

人ATP2A3基因慢病毒shRNA载体质粒的构建及鉴定

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