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血管内皮生长因子调节机制的研究

作　者: 周智超
导　师: 陆菊明
学　校: 南开大学
专　业: 内科学
关键词: 血管内皮生长因子 FHL1 Smad4 Mark1 转录因子
分类号:
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究分为两部分：第一部分：FHL1与Smad4协同抑制JVEGF信号通路血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)在缺血,急慢性炎症,以及肿瘤及创伤等血管生成异常疾病中起着重要作用。很多因子可以调节VEGF启动子活性及VEGF的表达。FHL1(four and a half LIM domains1)与Smad4便是其中2个可以调节VEGF启动子活性及VEGF的表达的因子。FHL-1隶属于LIM-only蛋白家族,这个家族可以调节基因转录、细胞增殖、分化与凋亡。Smad4是一种抑癌基因,最早发现于胰腺癌第4位点基因缺失(DPC4)。本研究为了确定FHL1与Smad4是否可以协同抑制VEGF信号通路。结果显示过表达的FHL1与Smad4可以协同抑制VEGF信号通路,而敲低内源性表达的Smad4与FHL-1则会刺激VEGF信号通路,并且敲低内源性Smad4表达会消除FHL-1介导的抑伟VEGF启动子活性作用。结论,本研究证实了FHL1与Smad4可以协同调节VEGF信号通路,可能发现了一种新的肿瘤的进展与转移机制。第二部分：MARK1对VEGF信号通路的调节本研究通过荧光素酶活性实验从704个转录调节因子中筛选出可以抑制VEGF启动子活性的Mark1蛋白。微管亲和力调节酶(microtubule affinity-regulating kinase, MARK)最初从小鼠脑组织中纯化出来,具有丝氨酸苏氨酸激酶活性。MARK蛋白属于AMPK/Snfl亚家族CaMKⅡ激酶组,有着保守结构域结构可以分为6个结构域,分别是：1.N端,2.催化域,3.普通停靠区域,4.泛素相关区域,5.沉默区,6.C端尾巴。接着本研究证实了Mark1抑制VEGF启动子活性成剂量依赖方式,并且同时通过Real-time PCR证实Mark1抑制VEGF启动子活性,构建了VEGF启动子突变体,利用荧光素酶活性实验证实VEGF启动子-800/-600是Mark1与其作用区域,并且构建Mark1相关突变体证实在103aa-311aa是Mark1抑制VEGF启动子的活性区域。同时通免疫组化实验证实Mark1在乳腺癌标本中癌旁组织表达高于癌组织,提示其可能机制是在乳腺癌组织中Mark1缺失,其抑制VEGF信号通路作用减弱,而促进乳腺癌的发生。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
符号说明  12-14
第一章引言  14-29
  第一节 VEGF概况  14-17
  第二节 VEGF在肿瘤中的作用  17-21
  第三节 VEGF靶向治疗  21-26
  第四节 HIF-1可以上调VEGF转录  26
  第五节 FHL1与Smad4与VEGF信号通路  26-27
  第六节 MARKI简介  27-29
第二章 FHL1与Smad4协同抑制VEGF信号通路  29-50
  第一节实验材料  29-32
    2.1.1 菌株与细胞株  29
    2.1.2 质粒  29
    2.1.3 常用分子生物学试剂盒  29-30
    2.1.4 细胞培养试剂  30
    2.1.5 其他分子生物学试剂和化学试剂  30
    2.1.6 抗体  30
    2.1.7 主要实验仪器  30-32
  第二节实验方法  32-42
    2.2.1 重组质粒构建与鉴定  32
    2.2.2 siRNAs表达载体的构建  32-33
    2.2.3 哺乳动物细胞的转染  33
    2.2.4 荧光素酶活性测定  33-34
    2.2.5 实时定量PCR分析(Real-time)PCR分析  34-35
    2.2.6 利用PCR扩增基因片段  35-36
    2.2.7 限制性内切酶消化DNA片段  36
    2.2.8 琼脂糖凝胶电泳  36-37
    2.2.9 DNA片段的胶回收  37-38
    2.2.10 DNA的连接反应  38
    2.2.11 大肠杆菌的制备  38
    2.2.12 大肠杆菌的转化  38-39
    2.2.13 重组子的筛选  39
    2.2.14 质粒提取  39-40
    2.2.15 酶联免疫吸附试验(ELISA)  40-41
    2.2.16 Western blot分析  41-42
    2.2.17 肿瘤细胞体外传代培养及保种  42
  第三节实验结果  42-48
    2.3.1 FHL1与Smad4协同抑制VEGF启动子活性  42-43
    2.3.2 敲低FHLl与Smad4协同增强VEGF启动子活性  43-45
    2.3.3 FHL1与Smad4协同抑制VEGF启动子活性  45-46
    2.3.4 FHL1与Smad4协同抑制VEGF表达  46-48
  第四节讨论  48-50
第三章 MARK1对VEGF信号通路的调节  50-77
  第一节实验材料  50-54
    3.1.1 菌株与细胞株  50
    3.1.2 质粒  50
    3.1.3 引物  50-51
    3.1.4 常用分子生物学试剂盒  51-52
    3.1.5 细胞培养试剂  52
    3.1.6 其他分子生物学试剂和化学试剂  52
    3.1.7 抗体  52
    3.1.8 主要实验仪器  52-54
  第二节实验方法  54-65
    3.2.1 重组质粒构建与鉴定  54-55
    3.2.2 哺乳动物细胞的转染  55
    3.2.3 荧光素酶活性测定  55-56
    3.2.4 实时定量PCR分析(Real-time)PCR分析  56-57
    3.2.5 利用PCR扩增基因片段  57-58
    3.2.6 限制性内切酶消化DNA片段  58
    3.2.7 DNA片段的胶回收  58-59
    3.2.8 DNA的连接反应  59
    3.2.9 大肠杆菌的制备  59-60
    3.2.10 大肠杆菌的转化  60
    3.2.11 免疫共沉淀  60
    3.2.12 免疫组化染色  60-61
    3.2.13 细胞免疫荧光染色  61-62
    3.2.14 免疫组化染色  62-64
    3.2.15 细胞免疫焚光染色  64-65
  第三节实验结果  65-76
    3.3.1 筛选与VEGF启动子结合的转录因子  65-66
    3.3.2 Mark1在不同乳腺癌细胞系中的内源表达  66
    3.3.3 构建VEGF系列启动子  66-67
    3.3.4 过量表达Mark1可以抑制VEGF-LUC的活性  67-69
    3.3.5 过量表达Mark1可以抑制VEGF启动子的活性  69-70
    3.3.6 Mark1与VEGF启动子结合序列的定位  70-71
    3.3.7 Mark1在细胞内定位  71-73
    3.3.8 Mark1系列突变体的构建  73
    3.3.9 Mark1抑制VEGF区域的定位  73-74
    3.3.10 Mark1在乳腺癌组织中的表达  74-76
  第四节讨论  76-77
第四章结论  77-78
参考文献  78-86
致谢  86-87
附录  87-100
个人简历  100-101

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