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间隙连接蛋白Cx43在醛固酮诱导的系膜细胞增殖模型中的作用及机制研究

作　者: 韩瑛
导　师: 甘卫华
学　校: 南京医科大学
专　业: 儿科学
关键词: Cx43 醛固酮 信号通路 细胞增殖
分类号: R-332
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景醛固酮作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)主要的效应分子,在慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的发病机制中发挥着重要作用。研究表明,醛固酮可以通过它的基因组和非基因组效应促进炎性反应、氧化应激、血管收缩和重塑、纤维化、以及细胞增殖、变形和分化而介导CKD的发生和发展。此外,系膜细胞病理性增殖及系膜基质的增多是肾小球肾炎中最常见的病理改变。因此,探明醛固酮调控肾脏系膜细胞增殖的可能机制,可能是临床寻找新的系膜增殖性相关肾病治疗策略以及延缓CKD进展的关键。随着间隙连接蛋白在肾脏组织中被检出及其在细胞生长调控中的重要作用越来越多地被发现,这为我们研究醛固酮调控肾脏系膜细胞增殖提供了新的思路。间隙连接蛋白是多基因编码的跨膜蛋白,其构成的细胞间隙连接通道可在细胞间介导分子质量低于lkd的离子或小分子物质如金属离子、第二信使及其他小分子代谢产物通过,在胚胎发育、组织修复、维持内环境稳态,尤其是控制细胞生长、分化等方面起着重要作用。在众多间隙连接蛋白中,Cx43是分布最广、研究最多的分子。Cx43对于细胞生长的调控主要通过两种方式实现：通道依赖性与非通道依赖性机制：前者是指它通过参与间隙连接通道形成来调控细胞生长,细胞间隙连接通讯功能异常时常常伴随细胞的异常生长；后者主要是指它可以直接调节细胞生长,与细胞间隙连接通讯功能无关。因此,本研究拟在探讨Cx43是否介导醛固酮引起的系膜细胞增殖,并且这种介导作用是否与细胞间隙连接通讯功能改变有关,以及醛固酮和Cx43之间调控的机制又如何。通过对醛固酮诱导的系膜细胞增殖可能的分子生物学机制的研究旨在为临床治疗系膜增殖性相关肾病提供一定的实验基础和理论依据。研究方法1、用3H-TdR掺入法观察不同浓度醛固酮(0.1、1、10、100nM)对大鼠系膜细胞增殖的影响以及盐皮质激素受体拮抗剂螺内酯(10nM)、不同信号通路抑制剂：ERKl/2通路-PD98059(10μM)、PI3K通路--LY294002(10μM)、PKC通路--GF109203X(10μM)对醛固酮(100nM)诱导的系膜细胞增殖情况的影响；2、RT-PCR法测定不同浓度醛固酮对系膜细胞Cx43基因表达的影响以及盐皮质激素受体拮抗剂、不同信号通路抑制剂对醛固酮(100nM)诱导的Cx43基因表达变化的影响；3、Western blot法测定不同浓度醛固酮对系膜细胞Cx43总蛋白表达的影响以及盐皮质激素受体拮抗剂、不同信号通路抑制剂对醛固酮(100nM)诱导的Cx43蛋白表达变化的影响；4、Western blot法测定不同浓度蛋白酶体抑制剂MG132(0.5、1、5、10μM)对Cx43表达的影响并确定提高Cx43表达的理想刺激浓度,联合3H-TdR掺入法测定提高Cx43表达的前提下,醛固酮促进系膜细胞增殖能力的变化。5、Lucifer Yellow划痕标记染料示踪技术(scrape loading and dye transfer,SLDT)观察不同浓度醛固酮对细胞间隙连接通讯功能的影响。6、激光共聚焦显微术结合Fura-3染色法,测定不同浓度醛固酮对细胞内游离钙离子([Ca2+]i)的影响。研究结果l、3H-TdR掺入法结果显示：醛固酮在0.1nM至100nM浓度范围内呈剂量依赖性地促进系膜细胞增殖(P<0.05)；盐皮质激素受体拮抗剂螺内酯、不同信号通路抑制剂：ERK1/2通路--PD98059、PI3K通路--LY294002、PKC通路-GF109203X均可不同程度地阻断醛固酮对系膜细胞增殖的促进作用(P<0.01),但各种抑制剂单独作用时对正常系膜细胞无明显影响(P>0.05)。2、RT-PCR结果显示：将对照组mRNA水平设为1,醛固酮浓度从0.1nM(0.90±0.02,P<0.05)至100nnM(0.32±0.03,P<0.01)呈浓度依赖性降低系膜细胞Cx43的mRNA相对表达量。各种阻断剂：螺内酯(0.92±0.02) PD98059(0.78±0.03).GF109203X(0.67±0.04)均能够阻断醛固酮对系膜细胞Cx43mRNA的下调作用(P<0.01),而LY294002(0.28±0.03)对100nnM醛固酮诱导的系膜细胞Cx43mRNA的下调无明显改善作用(P>0.05)。此外,各种阻断剂单独作用时对正常系膜细胞Cx43mRNA的表达无明显影响(P>0.05)。3、Western blot结果显示：醛固酮从O.1n M(0.91±0.02,P<0.05)至100nM(0.43±0.02,P<0.01)呈浓度依赖性减少系膜细胞Cx43总蛋白的合成。各种阻断剂：螺内酯(0.88±0.03).PD98059(0.69±0.05)、GF109203X (0.54±0.03)均能够阻断醛固酮对系膜细胞Cx43总蛋白的下调作用(P<0.01),而LY294002(0.33±0.04)对100nM醛固酮诱导的系膜细胞Cx43总蛋白的下调无明显改善作用(P>0.05)。此外,各种阻断剂单独作用时对正常系膜细胞Cx43总蛋白的表达无明显影响(P>0.05)。4、Westem blot联合3H-TdR掺入法结果显示：MG132从0.5μM至10μM呈浓度依赖性诱导系膜细胞Cx43总蛋白相对表达量上调(P<0.01),且在浓度为5μM即可明显地上调Cx43总蛋白表达；将5pM MG132联合不同浓度醛固酮共同孵育系膜细胞24h发现,联合刺激组与相应浓度的醛固酮单独刺激组相比,系膜细胞增殖能力均有不同程度地降低(P<0.05)。5、SLDT功能检测结果示：不同浓度的醛固酮对细胞间隙连接通讯功能的影响,与正常系膜细胞相比,无明显统计学差异(P>0.05)。6、激光共聚焦显微术结合Fura-3染色法,测定细胞内游离钙离子([Ca2+]i)浓度结果示：醛固酮呈浓度依赖性提高系膜细胞[Ca2+]i浓度：正常组(21.62±1.90)；0.1nM Aldo(29.92±1.87,p<0.05)；lnMAldo(37.20±2.1,p<0.01)；10nM Aldo(57.61±1.82,p<0.01)；100nMAldo (74.80±1.60,p<0.01)。研究结论醛固酮促进系膜细胞的增殖的可能机制之一是通过它的基因组效应从转录和翻译水平降低Cx43的基因和蛋白质表达,而非通过影响细胞间隙连接通讯功能实现的,且这一过程与盐皮质激素受体的介导以及ERK1/2、PKC通路而非PI3K通路的参与密切相关。

全文目录


中文摘要  5-9
英文摘要  9-14
前言  14-17
材料和方法  17-36
结果  36-44
讨论  44-51
小结  51-52
参考文献  52-57
综述  57-64
  参考文献  61-64
附录  64-65
已发表论文  65-66
致谢  66

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中图分类: > 医药、卫生 > 医学研究方法 > 实验医学、医学实验 > 医用实验动物学
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