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人参皂甙Rg3不同构型免疫佐剂作用和抗氧化作用及其机理的研究
作 者: 韦晓洁
导 师: 胡庭俊
学 校: 广西大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 人参皂甙 20(R)-Rg3 20(S)-Rg3 佐剂 Th1/Th2 抗氧化 呼吸爆发
分类号: R285
类 型: 博士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
人参皂苷Rg3(ginsenoside-Rg3)属于原人参二醇型皂苷,是一种从人参(Panax ginseng C. A. Meyer)中分离提取出来的天然化合物。由于其对肿瘤细胞有很强的抑制作用,所以在人医临床被广泛用于治疗各种肿瘤疾病。Rg3在自然界中存在20-C键的两种差向异构体,即20(R)-Rg3和20(S)-Rg3,近年来研究表明两种Rg3异构体在许多免疫活性研究中存在显著差异。因此,本论文通过研究Rg3两种异构体的免疫佐剂作用、抗氧化作用和对巨噬细胞功能的调节作用,研究Rg3两种异构体的免疫学特性,并比较两者间免疫活性的差异。1Rg3不同构型免疫佐剂作用的研究目的:采用OVA作为模式抗原,探讨Rg3两种不同构型的免疫佐剂作用和对小鼠Thl/Th2免疫平衡的调节机制。方法:将32只BALB/c小鼠随机分为4组,分别为生理盐水对照组、OVA对照组、OVA+20(R)-Rg3佐剂组和OVA+20(S)-Rg3佐剂组。第一次免疫后,间隔3周再免疫第二次。分别采集一免和二免后第14天小鼠血液,并检测血清IgM抗体水平、IgG及其亚类抗体水平。二免后第14天,所有供试小鼠处死并分离培养脾脏淋巴细胞,RT-PCR法检测OVA抗原刺激后脾淋巴细胞中相关细胞因子的表达;采用MTT法测脾淋巴细胞增殖试验;Western-blot法检测血清中细胞因子的表达。结果:20(R)-Rg3或20(S)-Rg3做为免疫佐剂与OVA对照组相比,均能显著提高小鼠一免和二免后血清中抗OVA特异性IgG及其亚类(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3)和IgM水平;促进小鼠脾淋巴体外增殖(P<0.05);显著增强细胞因子Interleukin-4(IL-4), Interleukin-10(IL-10), Interferon-y (IFN-y), Interleukin-12(IL-12)以及核转录因子T-bet和GATA-3的表达(P<0.05);显著增强血清中细胞因子Interleukin-5(IL-5)和Interferon-γ (IFN-γ)的表达(P<0.05)。且OVA+20(R)-Rg3组各项指标均优于OVA+20(S)-Rg3组。结果表明,20(R)-Rg3和20(S)-Rg3均具有明显的免疫佐剂效应,并且能调节机体Th1/Th2免疫平衡,20(R)-Rg3免疫佐剂效果优于其异构体20(S)-Rg3。2Rg3不同构型抗氧化作用的研究目的:用环磷酰胺(Cyclophosphamide Cy)建立小鼠免疫抑制模型,在此基础上应用20(R)-Rg3和20(S)-Rg3处理小鼠,观察20(R)-Rg3和20(S)-Rg3对免疫抑制小鼠胸腺指数、脾脏指数、酸性磷酸酶(Acid Phosphatase ACP)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase SOD)、一氧化氮(Nitric Oxide NO)、溶菌酶(Lysozyme LZM)、总抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity T-AOC)、黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase XOD)、过氧化氢酶(Catalase CAT)和丙二醛(Malondialdehyde MDA)等免疫学和抗氧化指标的影响,探讨20(R)-Rg3和20(S)-Rg3对小鼠抗氧化能力的调节作用。结果:20(R)-Rg3或20(S)-Rg3均可提高由Cy诱导的免疫抑制导致降低的小鼠胸腺指数、脾脏指数、ACP活性、SOD活性、LZM活性、T-AOC和CAT活性;降低Cy诱导的NO、XOD活性和MDA水平的升高。结果表明,20(R)-Rg3和20(S)-Rg3均能对抗Cy诱导的小鼠免疫抑制,具有明显的抗氧化作用,20(R)-Rg3抗氧化活性优于其异构体20(S)-Rg3。3Rg3不同构型对巨噬细胞功能调节作用的研究目的:体外分析20(R)-Rg3和20(S)-Rg3对巨噬细胞系RAW264.7(?)乎吸爆发和吞噬活性的影响及诱导鼠源巨噬细胞的细胞因子(IL-10和TNF-α)和Nuclear factor kappa B (NF-κB)分泌的作用。方法:实验一经20(R)-Rg3或20(S)-Rg3预培养的RAW264.7,用二氢诺丹明(Dihydrorhodaminel23DHR)处理后,与粉红色荧光乳胶微球共同培养,由于细胞的呼吸爆发作用可引起细胞内本身不发光的DHR转化为发绿色荧光的诺丹明(Rhodamine ROD),用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜同时测定粉红色荧光(代表细胞吞噬或粘附粉红色荧光微球的数量)和绿色荧光(间接反应了细胞呼吸爆发的力度),以检测20(R)-Rg3和20(S)-Rg3对巨噬细胞Raw2647呼吸爆发和吞噬活性的影响。实验二以Raw-blue cells作为研究对象,分别加入不同浓度的20(R)-Rg3或20(S)-Rg3(1、10、100μg/m1)以刺激细胞,然后从细胞培养上清中检测分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的表达。实验三以不同浓度的20(R)-Rg3或20(S)-Rg3(1、10、100μg/ml)刺激RAW264.7,并收集细胞,用RT-PCR法检测细胞分泌的细胞因子Interleukin-10(IL-10)水平和Tumor necrosis factor-α (TNF-α)水平。结果:20(R)-Rg3能显著提高RAW264.7的呼吸爆发作用和吞噬活性(P<0.05),相反,20(S)-Rg3显著抑制了正常RAW264.7的呼吸爆发作用和吞噬活性(P<0.05);20(R)-Rg3或20(S)-Rg3刺激细胞内NF-κBB的活化随浓度的不断增大而降低,但不受LPS特异性抑制剂PMB抑制,且20(R)-Rg3刺激细胞内NF-κB的活化程度大于20(S)-Rg3(P<0.05);体外20(R)-Rg3或20(S)-Rg3刺激细胞内TNF-a和IL-10的分泌随浓度的不断增大而降低。与20(S)-Rg3相比,20(R)-Rg3能显著刺激细胞内TNF-a和IL-10的分泌(P<0.05)。结果表明,20(R)-Rg3可能是通过增强细胞呼吸爆发作用和吞噬作用清除机体内的活性氧自由基,发挥抗氧化作用,但20(S)-Rg3抑制细胞呼吸爆发作用和吞噬作用的机制有待进一步研究。综上所述,20(R)-Rg3的免疫佐剂作用、抗氧化能力和巨噬细胞调节作用都优于20(S)-Rg3,是一种理想的免疫调节剂。
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全文目录
摘要 3-6 ABSTRACT 6-13 前言 13-14 图目录 14-16 表目录 16-17 英文缩写注释 17-18 第一章 人参及其免疫调节作用 18-27 1 人参的分类 18-19 2 人参的活性成分 19-21 3 人参皂苷的生物学活性 21-25 3.1 免疫调节作用 21-22 3.1.1 促进免疫器官的发育 21 3.1.2 对T淋巴细胞的作用 21 3.1.3 对B淋巴细胞的作用 21-22 3.1.4 对巨噬细胞的作用 22 3.1.5 对自然杀伤细胞的作用 22 3.1.6 对细胞因子的作用 22 3.2 抗肿瘤作用 22-23 3.3 抗病毒作用 23 3.3.1 体内抗病毒作用 23 3.3.2 体外抗病毒作用 23 3.4 抗衰老作用 23-24 3.5 抗氧化作用 24 3.6 对血液系统的影响 24 3.7 对内分泌系统的调节 24-25 3.8 对cGMP/cAMP的调节 25 3.9 对体液免疫功能的影响 25 4 人参的应用概况 25-26 5 市场前景与展望 26-27 第二章 Rg3不同构型佐剂作用的研究 27-45 1 引言 27-28 2 材料与方法 28-36 2.1 材料 28-29 2.1.1 实验动物 28 2.1.2 试剂与耗材 28-29 2.1.3 细胞系 29 2.1.4 主要设备 29 2.2 试验方法 29-36 2.2.1 抗原(OVA)去除内毒素 29-31 2.2.2 动物免疫与分组 31 2.2.3 间接酶联免疫法(ELISA)检测抗OVA特异性IgG、IgG亚类和IgM抗体水平 31-32 2.2.4 淋巴细胞增殖实验 32 2.2.5 RT-PCR法相对定量目的基因的表达 32-34 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性 34-35 2.2.7 Western blot法测定血清中细胞因子 35-36 3 数据统计 36 4 结果与分析 36-42 4.1 抗原OVA除内毒素 36-37 4.2 血清抗OVA特异性IgG和IgM抗体水平 37-38 4.3 血清抗OVA特异性IgG亚类抗体水平 38 4.4 淋巴细胞增殖实验 38-39 4.5 RNA完整性的检测 39-40 4.6 细胞因子、GATA和T-bet mRNA的表达 40-41 4.7 血清中IFN-γ和IL-5的测定结果 41-42 5 讨论 42-45 第三章 Rg3不同构型对小鼠活性氧水平的影响 45-63 1 引言 45-46 2 材料与方法 46-50 2.1 材料 46-47 2.1.1 实验动物 46 2.1.2 试剂与耗材 46 2.1.3 主要设备 46-47 2.2 试验方法 47-50 2.2.1 动物分组与处理 47 2.2.2 酸性磷酸酶的测定 47-48 2.2.3 超氧化物歧化酶的测定 48 2.2.4 一氧化氮的测定 48 2.2.5 溶菌酶的测定 48-49 2.2.6 总抗氧化能力的测定 49 2.2.7 黄嘌呤氧化酶的测定 49 2.2.8 过氧化氢酶的测定 49-50 2.2.9 丙二醛的测定 50 2.2.10 组织匀浆中蛋白含量的测定 50 3 数据统计 50 4 结果与分析 50-60 4.1 Rg3对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响 50-51 4.2 Rg3对小鼠血清和免疫器官中ACP活性的影响 51-52 4.3 Rg3对小鼠血清和免疫器官中SOD活性的影响 52-54 4.4 Rg3对小鼠血清和免疫器官中NO水平的影响 54 4.5 Rg3对小鼠血清和免疫器官中LZM活性的影响 54-56 4.6 Rg3对小鼠血清和免疫器官中T-AOC的影响 56-57 4.7 Rg3对小鼠血清和免疫器官中XOD活性的影响 57-58 4.8 Rg3对小鼠血清和免疫器官中CAT活性的影响 58-59 4.9 Rg3对小鼠血清和免疫器官中MDA水平的影响 59-60 5 讨论 60-63 第四章 Rg3不同构型对巨噬细胞作用的研究 63-77 1 引言 63 2 材料方法 63-68 2.1 材料 63-64 2.1.1 细胞系与培养基 63 2.1.2 主要试剂与耗材 63-64 2.1.3 主要设备 64 2.2 方法 64-68 2.2.1 主要试剂的配制 64 2.2.2 Raw264.7呼吸爆发和吞噬活性的测定 64-65 2.2.3 Rg3活化巨噬细胞NF-κB的检测 65-67 2.2.4 Rg3刺激巨噬细胞分泌细胞因子的检测 67-68 3 数据统计 68 4 结果与分析 68-75 4.1 流式细胞仪测定RAW264.7呼吸爆发作用 69-70 4.2 流式细胞仪测定Raw264.7吞噬活性 70-71 4.3 激光共聚焦显微镜测定Raw264.7呼吸爆发作用和吞噬活性 71-73 4.4 Rg3对巨噬细胞NF-κB的影响 73-74 4.5 Rg3对巨噬细胞分泌细胞因子的影响 74-75 5 讨论 75-77 结论 77-78 创新点 78-79 后续研究展望 79-80 参考文献 80-88 附录 常用试剂配方 88-91 致谢 91-92 攻读博士学位期间主要研究成果 92-93
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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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