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蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖活性和结构的研究

作　者: 于士军
导　师: 樊美珍
学　校: 安徽农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 多糖 抗氧化 免疫调节 佐剂性关节炎 贫血 结构分析
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本研究针对蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali Chen et Dai）发酵液多糖的活性和活性较高多糖组分的结构开展了一系列的实验研究，主要内容包括蝙蝠蛾拟青霉发酵液多糖的分级醇沉、不同分级醇沉粗多糖组分对果蝇寿命和果蝇体内SOD活力及MDA含量的影响，并从中选择活性最高的粗多糖进行进一步的研究。对活性最高的多糖组分进行了免疫调节活性、对佐剂性关节炎大鼠和失血性贫血小鼠的作用等方面的研究；然后用DE-52纤维素离子交换层析柱和Saphedax G-150交联葡聚糖凝胶层析柱对该粗多糖组分进行了分离纯化；之后，对分离纯化的多糖组分的抗肿瘤活性及结构分别进行了研究和分析。将蝙蝠蛾拟青霉发酵得到的发酵醪经16000rpm离心10min，除去菌丝；发酵液在45℃条件下真空旋转浓缩至原体积的1/4，分别依次加入乙醇使乙醇的终浓度为20%、30%、40%、50%、60%和70%分级沉淀得到粗多糖。将乙醇终浓度为20%、30%、40%、50%、60%和70%时，醇沉得到的蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖组分分别标记为P20、P30、P40、P50、P60、P70，其得率分别为：0.13、0.08、0.06、0.78、0.45和0.18mg/mL。将不同乙醇浓度沉淀得到的粗多糖按1%（W/V）剂量分别添加到果蝇的饲料中，以不添加多糖组作为对照组（CK），进行饲养。实验结果表明粗多糖P60延缓衰老作用最好，对雌雄果蝇的半数死亡时间、平均寿命和平均最高寿命的延长率分别是6.47%、15.83%，17.04%、18.36%，28.81%和17.87%。P50和P60，可显著提高果蝇体内的SOD活性，并降低MDA含量，且P60作用效果较好。P60对雌雄果蝇体内SOD活力分别提高28.02%和26.85%，MDA含量分别降低50.67%和54.30%。表明蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖P60具有良好的抗氧化和延缓衰老作用，将其选择作为进一步研究的对象。粗多糖P60的免疫调节实验结果表明：300mg/kg的蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖P60能明显促进正常小鼠胸腺指数和脾脏指数的增长，增强小鼠的免疫功能。300mg/kg和450mg/kg均能提高免疫抑制的小鼠的免疫功能，也能抑制小鼠迟发型超敏反应；300mg/kg蝙蝠蛾拟青霉粗多糖P60能促进小鼠巨噬细胞增生，激活吞噬活性，增强小鼠吞噬异物能力。佐剂性关节炎大鼠模型实验结果表明：蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖P60能抑制佐剂性关节炎大鼠左足趾继发性肿胀的程度，并对佐剂性关节炎大鼠血清内TGF-β1、TNF-α产生有一定的作用：促进佐剂性关节炎大鼠血清内TGF-β1的浓度升高，对佐剂性关节炎大鼠血清中促炎性细胞因子TNF-α的产生有一定的抑制作用；而对于IL-1β的产生无明显的影响作用。表明蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖P60对佐剂性关节炎有一定的治疗作用。失血性贫血小鼠实验结果显示：用蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖P60对失血性贫血小鼠进行灌胃28天后，低剂量组和高剂量组失血性贫血小鼠的外周血血红蛋白含量恢复正常，同时，外周血红细胞数也恢复至正常小鼠水平；并且有利于单核细胞和中性粒细胞恢复至正常小鼠水平；但是对小鼠血小板数和白细胞总数无明显的影响。粗多糖P60经Saveg试剂除蛋白，然后用DE-52纤维素离子交换层析柱进行初步纯化得到4个组分：PS1、PS2、PS3和PS4；将4个组分分别再经Sephadex G-150交联葡聚糖凝胶层析柱进行进一步的分离纯化，PS1和PS3仍是单一峰，PS2和PS4分别分离出2个组分：PS2-1、PS2-2和PS4-1、PS4-2。6个样品经Sephadex G-150交联葡聚糖凝胶层析检测和紫外200-400nm扫描初步判定均为均一性多糖。将粗多糖P60和分离纯化得到的纯化多糖组分分别进行对肺癌细胞A549、黑色素瘤细胞B-16、鼻咽癌细胞CNE和肝癌细胞HepG2增殖的抑制实验。实验结果表明：处理24h后，0.05μg/mL的粗多糖P60对A549细胞增殖的抑制作用较好，抑制率达到37.37%；浓度为5μg/mL多糖PS4-1对B-16细胞增殖的抑制作用达到32.54%；浓度为500μg/mL多糖PS3对CNE细胞增殖抑制作用较好，抑制率达到28.93%；浓度为50μg/mL多糖PS4-1对HepG2细胞增殖的抑制作用最好达到29.51%。处理48h后，0.05μg/mL粗多糖P60对A549细胞增殖的抑制作用较好，抑制率达到42.00%；浓度为5μg/mL多糖PS3对B-16细胞增殖的抑制作用最佳，抑制率达到47.15%；浓度为500μg/mL多糖PS3对CNE细胞增殖的抑制作用较好达到37.06%；浓度为500μg/mL多糖PS4-1对HepG2细胞增殖的抑制作用最高，抑制率达到42.51%。处理72h后，浓度为0.05μg/mL的粗多糖P60对A549抑制作用最佳，抑制率达到49.64%；浓度为5μg/mL多糖PS3对B-16细胞增殖的抑制作用达到52.81%；浓度为500μg/mL多糖PS4-1对CNE的抑制作用较好，抑制率达到59.84%；浓度为50μg/mL多糖PS3对HepG2细胞增殖的抑制作用达到56.17%。通过对多糖样品的FTIR、GC-MS、1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC和HMBC等分析，分别初步推测6个多糖样品的可能结构如下：PS1的分子量为361kDa，由葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成，三者的摩尔比为5.15:0.30:0.10，其可能结构是以-1,6-D-Glcp连接形成主链，在-1,6-D-Glcp的3位处产生支链，与-1,3-D-Galp和β-1,3-D-Manp相连，端基由Glcp、Galp和Manp组成。其主链结构如下：→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→PS2-1的分子量为412kDa，由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖和甘露糖组成，单糖的摩尔比为：3.98:1.00:0.28:0.33:0.18；其可能结构为以β-1,4-D-Galp连接形成主链，在β-1,4-D-Galp的3位处产生支链，与-1,3-D-Alap相连形成重复单位，含有少量的Xyl、Man和Glc残基。根据上述结果，PS2-1可能存在如下重复单元：PS2-2的分子量为48kDa，由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，三者的摩尔比为：0.14:5.10:0.32；其可能结构为以-1,6-D-Glcp连接形成主链，在-1,6-D-Glcp的3位处产生支链，与-1,3-D-Galp和β-1,3-D-Manp相连，端基由Glcp、Galp和Manp组成。其主链结构如下：→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→PS3的分子量为536kDa，由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖组成，四者的摩尔比为：0.62:0.34:0.13:4.62；其可能结构是以半乳糖残基通过β-1,4-糖苷键连接形成主链结构，葡萄糖残基通过β-1,3-糖苷键连接到半乳糖的C3上，部分阿拉伯糖残基或木糖残基通过α-1,3-糖苷键连接至葡萄糖残基的C3；其余阿拉伯糖残基或木糖残基通过β-1,3-糖苷键连接到半乳糖主链上。其主链结构式如下：→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→PS4-1的分子量为729kDa，由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，三者的摩尔比为1.13:0.21:4.40；其可能结构是半乳糖残基通过β-1,4-糖苷键连接形成主链结构，阿拉伯糖残基和葡萄糖残基通过β-1,3-糖苷键连接到半乳糖主链上，每4个半乳糖残基连接1个阿拉伯糖残基。每5个上述半乳糖残基和阿拉伯糖残基的重复单元通过β-1,3-糖苷键连接1个葡萄糖残基。即每5个通过β-1-3糖苷键连接1个D-Glcp残基。PS4-2的分子量为668kDa，由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，三者的摩尔比为：0.62:0.57:4.46；其可能的结构是半乳糖残基通过β-1,4-糖苷键连接形成主链结构，阿拉伯和葡萄糖残基糖残基通过β-1,3-糖苷键连接到半乳糖主链上，约每15个半乳糖残基连接2个阿拉伯糖残基和2个葡萄糖残基。其可能的主要结构式如下：

全文目录


摘要  3-6
Abstract  6-10
目录  10-17
插图清单  17-20
附表清单  20-21
主要缩略词和符号表  21-23
第一章 文献综述  23-33
  1 糖生物学发展动态  23-26
    1.1 概述  23-24
    1.2 糖生物学国外发展动态  24-25
    1.3 糖生物学国内发展动态  25-26
  2 真菌多糖研究开发动态  26-33
    2.1 真菌多糖的研究进展  26-27
    2.2 真菌多糖的功能  27-30
      2.2.1 免疫调节作用  27-28
      2.2.2 抗肿瘤作用  28
      2.2.3 抗氧化作用  28-29
      2.2.4 抗炎作用  29
      2.2.5 抗衰老作用  29
      2.2.6 抗病毒作用  29-30
      2.2.7 降血糖、血脂、胆固醇作用  30
      2.2.8 其它作用  30
    2.3 真菌多糖的结构层次及其分析  30-31
      2.3.1 真菌多糖的结构层次  30-31
      2.3.2 真菌多糖结构的分析  31
    2.4 真菌多糖的构效关系  31-33
      2.4.1 主链连接方式对生物活性的影响  31
      2.4.2 分支度和分子大小对生物活性的影响  31-32
      2.4.3 侧链基团的性质对生物活性的影响  32-33
第二章 引言  33-35
  1 研究目的与意义  33
  2 本论文的主要研究内容  33-35
第三章 分级醇沉粗多糖对果蝇寿命和果蝇体内SOD活力和MDA含量的影响  35-42
  引言  35
  1 材料与方法  35-38
    1.1 实验材料  35-36
      1.1.1 实验仪器  35
      1.1.2 供试菌株和动物  35
      1.1.3 实验试剂  35-36
      1.1.4 培养基  36
    1.2 实验方法  36-38
      1.2.1 菌株活化  36
      1.2.2 菌株的摇瓶与发酵罐培养  36
      1.2.3 胞外多糖的提取  36
      1.2.4 葡萄糖标准曲线的绘制和样品多糖含量测定  36-37
      1.2.5 分级沉淀胞外粗多糖的功能的测定  37-38
  2 结果与分析  38-40
    2.1 葡萄糖标准曲线  38
    2.2 蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖含量  38-39
    2.3 蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖对果蝇寿命的影响  39
    2.4 蛋白质标准曲线与果蝇组织匀浆蛋白含量的测定  39
    2.5 蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖对果蝇对果蝇体内总SOD活力和MDA含量的影响  39-40
  3 结论与讨论  40-42
第四章 蝙蝠蛾拟青霉粗多糖P60 免疫活性的研究  42-49
  前言  42
  1 材料与方法  42-44
    1.1 仪器  42
    1.2 试剂  42
    1.3 动物  42
    1.4 免疫活性研究  42-43
      1.4.1 正常小鼠免疫实验  42
      1.4.2 免疫低下模型小鼠实验  42-43
      1.4.3 给药  43
      1.4.4 胸腺指数和脾脏指数  43
      1.4.5 单核巨噬细胞功能实验-小鼠碳粒廓清法  43
      1.4.6 细胞免疫功能实验-二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应（DTH）  43
    1.5 实验数据统计分析  43-44
  2 结果与分析  44-48
    2.1 粗多糖P60 对正常小鼠免疫功能的研究  44-46
      2.1.1 对正常小鼠体重的影响  44
      2.1.2 对正常小鼠胸腺指数的影响  44-45
      2.1.3 对正常小鼠脾脏指数的影响  45
      2.1.4 对正常小鼠碳廓清指数的影响  45-46
      2.1.5 对正常小鼠吞噬指数的影响  46
    2.2 粗多糖P60 对免疫低下小鼠免疫功能器官指数的研究  46-47
      2.2.1 对免疫低下小鼠胸腺指数的影响  46-47
      2.2.2 对免疫低下小鼠脾脏指数的影响  47
    2.3 对迟发型变态反应小鼠免疫器官指标和耳廓肿胀度的影响  47-48
  3 结论与讨论  48-49
第五章 蝙蝠蛾拟青霉粗多糖P60 对佐剂性关节炎大鼠的作用  49-58
  引言  49-51
  1 材料与方法  51-52
    1.1 实验动物  51
    1.2 实验方法  51-52
      1.2.1 分组  51
      1.2.2 造模  51
      1.2.3 给药  51
      1.2.4 观察指标测定  51
      1.2.5 Elisa法细胞因子测定  51-52
    1.3 实验数据统计分析  52
  2 结果与分析  52-56
    2.1 体重变化过程  52-53
    2.2 足跖肿胀变化  53-54
      2.2.1 右足跖肿胀变化  53
      2.2.2 左足跖肿胀变化  53-54
    2.3 细胞因子标准曲线的绘制  54-55
      2.3.1 TGF-β1 标准曲线  54
      2.3.2 TNF-α标准曲线  54
      2.3.3 IL-1β标准曲线  54-55
    2.4 鼠血清中三种细胞因子的测定  55-56
      2.4.1 TGF-β1 的测定  55
      2.4.2 TNF-α的测定  55-56
      2.4.3 IL-1β的测定  56
  3 结论与讨论  56-58
第六章 蝙蝠蛾拟青霉粗多糖P60 对失血性贫血小鼠的影响  58-65
  前言  58-59
  1 材料与方法  59-60
    1.1 材料  59
      1.1.1 实验动物  59
      1.1.2 试剂  59
      1.1.3 仪器  59
    1.2 方法  59-60
      1.2.1 饲养条件  59
      1.2.2 分组和给药  59-60
      1.2.3 造模  60
      1.2.4 外周血中血红蛋白含量测定  60
    1.3 统计学分析  60
  2 结果与分析  60-64
    2.1 血红蛋白测定  60-61
    2.2 对红细胞的影响  61-62
    2.3 对血小板的影响  62
    2.4 对白细胞的影响作用  62-64
  3 结论与讨论  64-65
第七章 蝙蝠蛾拟青霉粗多糖P60 的分离纯化  65-76
  引言  65-66
  1 材料与方法  66-68
    1.1 实验材料  66-67
      1.1.1 实验仪器  66
      1.1.2 实验试剂  66-67
    1.2 实验方法  67-68
      1.2.1 苯酚-硫酸法  67
      1.2.2 虫草胞外粗多糖除蛋白的正交实验  67
      1.2.3 葡萄糖标准曲线的绘制  67
      1.2.4 蛋白质标准曲线的绘制  67
      1.2.5 DE-52 纤维素离子交换层析柱分离纯化  67-68
      1.2.6 Sephadex G-150 交联葡聚糖凝胶分离纯化  68
      1.2.7 多糖均一度检验  68
  2 结果与分析  68-75
    2.1 正交实验分配与结果  68-69
    2.2 DE-52 纤维素离子交换层析柱分离纯化  69-70
    2.3 Sephadex G-150 交联葡聚糖凝胶层析  70-72
      2.3.1 PS1 的Sephadex G-150 分离纯化  70
      2.3.2 PS2 的Sephadex G-150 分离纯化  70-71
      2.3.3 PS3 的Sephadex G-150 分离纯化  71
      2.3.4 PS4 的Sephadex G-150 分离纯化  71-72
    2.4 样品均一度的凝胶层析色谱检测  72-74
      2.4.1 PS1 均一度检测  72
      2.4.2 PS2-1 均一度检测  72
      2.4.3 PS2-2 均一度检测  72-73
      2.4.4 PS3 均一度检测  73
      2.4.5 PS4-1 均一度检测  73-74
      2.4.6 PS4-2 均一度检测  74
    2.5 纯化多糖样品的紫外分析  74-75
  3 结论与讨论  75-76
    3.1 Sevag法除蛋白  75
    3.2 胞外多糖纯化方法的优化：  75-76
第八章 多糖体外抗肿瘤活性研究  76-89
  前言  76-77
  1 材料与方法  77-79
    1.1 实验材料  77-78
      1.1.1 主要试剂  77
      1.1.2 主要仪器  77-78
      1.1.3 细胞株  78
      1.1.4 主要溶液配制  78
    1.2 实验方法  78-79
      1.2.1 细胞培养和传代  78
      1.2.2 细胞冻存和复苏  78-79
      1.2.3 多糖溶液的配制  79
      1.2.4 细胞计数方法  79
      1.2.5 MTT实验检测细胞活力  79
      1.2.6 B-16、CNE和HepG2 处理方法同A549  79
    1.3 统计学处理  79
  2 结果与分析  79-87
    2.1 蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖P60 体外抗肿瘤活性  79-81
    2.2 蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖PS1 体外抗肿瘤活性  81-82
    2.3 蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖PS2-1 体外抗肿瘤活性  82-83
    2.4 蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖PS2-2 体外抗肿瘤活性  83-84
    2.5 蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖PS3 体外抗肿瘤活性  84-85
    2.6 蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖PS4-1 体外抗肿瘤活性  85-86
    2.7 蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖PS4-2 体外抗肿瘤活性  86-87
  3 结论与讨论  87-89
第九章 多糖结构分析  89-121
  前言  89-90
  1 材料与方法  90-92
    1.1 实验材料  90
      1.1.1 主要试剂  90
      1.1.2 主要仪器  90
    1.2 实验方法  90-92
      1.2.1 分子量测定  90-91
      1.2.2 单糖组成测定  91
      1.2.3 红外光谱分析  91-92
      1.2.4 核磁共振分析  92
  2 结果与分析  92-118
    2.1 分子量测定  92-93
      2.1.1 标准曲线的绘制  92
      2.1.2 多糖分子量测定结果  92-93
    2.2 单糖组成  93-96
      2.2.1 标准单糖衍生物的气相色分析  93
      2.2.2 PS1 衍生物的气相色分析  93-94
      2.2.3 PS2-1 衍生物的气相色分析  94
      2.2.4 PS2-2 衍生物的气相色分析  94-95
      2.2.5 PS3 衍生物的气相色分析  95
      2.2.6 PS4-1 衍生物的气相色分析  95-96
      2.2.7 PS4-2 衍生物的气相色分析  96
    2.3 红外光谱分析  96-100
      2.3.1 PS1 的红外光谱实验结果与分析  96-97
      2.3.2 PS2-1 的红外光谱实验结果与分析  97-98
      2.3.3 PS2-2 的红外光谱实验结果与分析  98
      2.3.4 PS3 的红外光谱实验结果与分析  98-99
      2.3.5 PS4-1 的红外光谱实验结果与分析  99
      2.3.6 PS4-2 的红外光谱实验结果与分析  99-100
    2.4 多糖结构的核磁分析  100-118
      2.4.1 PS1 结构的NMR分析  100-105
      2.4.2 PS2-1 结构的NMR分析  105-108
      2.4.3 PS2-2 结构的NMR分析  108-110
      2.4.4 PS3 结构的NMR分析  110-113
      2.4.5 PS4-1 结构的NMR分析  113-115
      2.4.6 PS4-2 结构的NMR分析  115-118
  3 结论与讨论  118-121
第十章 结论  121-124
创新点  124-125
参考文献  125-136
致谢  136-137
作者简介  137-138
在读期间发表学术论文  138

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