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银杏酸（C17：1）的药物代谢和动力学研究

作　者: 李力
导　师: 曾苏
学　校: 浙江大学
专　业: 药物分析学
关键词: GA(C17) GA(C15)代谢 细胞毒性 药物动力学 P-糖蛋白 乳腺癌耐药蛋白
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


银杏作为公认的预防和治疗心脑血管疾病的药物,在世界范围内有着极为广泛的应用。银杏酸(Ginkgolic Acids,简称GAs)是存在于银杏叶、果和外种皮中的生物活性成分,以外种皮中的含量最高。银杏酸是一类水杨酸衍生物,苯环6位上的侧链碳原子数为13至19个,侧链双键数为0至3个。其中银杏酸(C15：1,GA2)和(C17：1,GA5)是主要的化学成分,其含量约占到银杏酸总量的80%。银杏酸被认为是引起银杏制剂不良反应的主要原因,可引起细胞毒性、致敏、致突变、致癌、肝毒性和肾毒性等。另一方面,随着研究的深入发现银杏酸也具有广泛的药理活性,包括抗菌、抗炎、抗过敏、杀虫等作用,体外和体内对多种肿瘤细胞显示不同程度的抑制生长作用,对HIV病毒也有很好的抑制效果。关于银杏酸的研究多集中在药理和毒理方面,药物代谢及其动力学(DM/PK)的研究报道甚少。本研究在先期GA(C15：1)工作的的基础上,从银杏酸总酸提取物中分离、制备GA(C15：1)和GA(C17：1),进而采用各种体内外模型对GA(C17：1)的吸收、转运、代谢、排泄与动力学的性质进行了较系统的研究。本文的研究结果可为银杏酸的进一步开发提供理论和实验依据。1.GA(C17：1)在大鼠肝微粒体中的代谢研究GA(C17：1)可由CYPs酶介导发生Ⅰ相氧化代谢,UGTs介导发生Ⅱ相代谢。化学抑制剂实验表明,大鼠肝微粒体的CYP1A1/2和CYP3A是介导GA(C17:1)I相代谢的主要酶亚型,UGT1A7和UGT1A9为介导GA(C17:1)Ⅱ相代谢的酶亚型。GA(C17：1)对CYP1A1/2、CYP2D1、CYP2E1和CYP3A2没有抑制作用,对CYP2C6有中等程度的抑制作用(Ki=5.26±1.07μmol/L)。使用LC/MS-MS初步分析了GA(C17：1)在大鼠肝微粒体中的代谢物,GA(C17：1)经大鼠肝药酶代谢可发生羟基化和葡萄糖醛酸结合反应,生成三种代谢物(两个羟基化代谢物和一个葡萄糖醛酸结合代谢物)。2.GA(C17：1)在人肝微粒体和人重组酶中的代谢研究通过人肝微粒体中代谢研究发现,GA(C17：1)与人肝微粒体的亲和力小于大鼠肝微粒体。在人肝微粒体和重组酶中,CYP3A4和CYP1A2是介导GA(C17：1)代谢的两种CYPs酶亚型,UGT1A6、UGT1A9和UGT2B15是介导GA(C17：1)葡萄糖醛酸结合的主要亚型。GA(C17：1)对CYP2C9有中等程度的抑制作用。报告基因法显示,10μmol/L的GA(C17：1)对CYP2B6和CYP3A4基本没有诱导作用(<30%利福平诱导能力),对UGT1A1基因诱导作用存在浓度依赖性。3.GA(C17：1)在HepG2、大鼠原代肝细胞和L02细胞上的代谢和毒性研究GA(C17：1)对不同类型的肝细胞HepG2、大鼠原代肝细胞和L02细胞均存在一定程度的毒性。CYP酶的化学诱导剂β-萘黄酮和利福平能够降低HepG2细胞和大鼠原代肝细胞的存活率；CYP酶的化学抑制剂α-萘黄酮和酮康唑能够增加原代肝细胞的存活率。与大鼠原代肝细胞和L02细胞相比,GA(C17：1)对HepG2有更大的细胞毒性作用,并且I相代谢酶CYP1A和CYP3A能够通过生物转化使GA(C17：1)的毒性增加。4.GA(C17：1)和GA(C15：1)在MDRl和BCRP转基因细胞模型上的转运研究采用MDCK-MDR1和LLC-PK1-BCRP转基因细胞模型,研究了GA(C17：1)和GA(C15：1)的转运机制以及对P-gp功能的影响。结果表明,GA(C17：1)和GA(C15：1)均为外排转运体P-gp和BCRP的底物,提示GA(C17：1)和GA(C15：1)的口服生物利用度有限,并难以透过血脑屏障进入脑部。GA(C17：1)和GA(C15：1)对P-gp的外排功能也有一定的抑制作用。5.GA(C17：1)在大鼠体内的药物动力学,组织分布和排泄研究建立了测定大鼠体内生物样品中GA(C17：1)的LC-MS/MS法,该方法具有操作简便、灵敏度高、稳定性、重复性好等优点。药物动力学研究表明：GA(C17：1)吸收较快,生物利用度为19.5%,GA(C17：1)在大鼠体内分布广泛,在肝脏和肾脏中浓度较高,并难以透过血脑屏障,粪便排泄是其主要的排泄途径。在粪便中鉴定了两个GA(C17：1)的代谢产物。6.银杏酸提取物在大鼠体内的药物动力学研究建立了同时测定血浆中GA(C17：1)和GA(C15：1)的快速、准确、高灵敏LC-MS/MS法,并将此方法成功应用于银杏酸提取物在大鼠体内的药物动力学研究。结果表明,与银杏酸单体给药相比,GA(C17：1)和GA(C15：1)的药动学参数有了一定程度的改变。大鼠静脉给予P-gp和BCRP抑制剂CsA可以显著提高GA(C17：1)和GA(C15：1)血药浓度水平。此外,CsA还可以通过抑制脑中P-gp,增加GA(C17：1)和GA(C15：1)在脑中的分布。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-9
Abstract  9-13
缩略词  13-21
第一章 前言  21-30
  1.1 有毒中药或中药有毒成分研究进展  21-24
    1.1.1 有毒中药或者中药有毒成分的研究意义  21
    1.1.2 有毒中药或者中药有毒成分的药物代谢和药物动力学研究进展  21-24
  1.2 银杏酸的研究进展  24-30
    1.2.1 银杏酸的生物活性研究  25-27
    1.2.2 银杏酸的毒理作用  27-28
    1.2.3 银杏酸的提取和检测方法  28
    1.2.4 银杏酸的研究前景  28-30
第二章 银杏酸单一成分的制备  30-35
  2.1 实验仪器与材料  30
    2.1.1 仪器  30
    2.1.2 试剂与药品  30
  2.2 实验方法  30-34
    2.2.1 GA(C15：1)和GA(C17：1)的制备  30-31
    2.2.2 GA(C15：1)和GA(C17：1)的质谱分析  31-33
    2.2.3 GA(C15：1)和GA(C17：1)的纯度测定  33-34
  2.3 小结  34-35
第三章 GA(C17：1)在大鼠肝微粒体的代谢研究  35-55
  3.1 实验仪器与材料  35-37
    3.1.1 仪器  35-36
    3.1.2 试剂与药品  36
    3.1.3 实验相关试药和试液配制  36-37
  3.2 实验方法  37-41
    3.2.1 大鼠肝微粒体的制备  37
    3.2.2 BCA测定大鼠肝微粒体浓度  37-38
    3.2.3 大鼠肝微粒体中代谢方法  38-39
    3.2.4 大鼠肝微粒体诱导方法  39
    3.2.5 酶动力学参数测定  39
    3.2.6 抑制试验  39
    3.2.7 GA(C17：1)对CYPs的抑制作用  39-40
    3.2.8 GA(C17：1)在大鼠肝微粒体中的分析方法  40-41
  3.3 实验结果  41-53
    3.3.1 分析方法学验证  41-43
    3.3.2 一相代谢结果  43-50
    3.3.3 二相代谢结果  50-53
  3.4 讨论  53-54
  3.5 本章小结  54-55
第四章 GA(C17：1)在人肝微粒体和重组酶中的代谢研究  55-67
  4.1 实验仪器与材料  55-56
    4.1.1 仪器  55
    4.1.2 试剂与样品  55-56
    4.1.3 试验相关溶液和试剂配制  56
  4.2 实验方法  56-58
  4.3 实验结果  58-64
    4.3.1 一相代谢结果  59-61
    4.3.2 二相代谢结果  61-64
  4.4 讨论  64-66
  4.5 本章小结  66-67
第五章 GA(C17：1)在HepG2细胞、大鼠原代肝细胞和L02细胞中的代谢和毒性研究  67-82
  5.1 实验仪器与材料  67-69
    5.1.1 仪器  67
    5.1.2 试剂与药品  67-68
    5.1.3 常用试剂配制  68-69
  5.2 实验方法  69-73
    5.2.1 细胞培养  70-71
    5.2.2 细胞的传代  71
    5.2.3 细胞毒性研究方法  71-72
    5.2.4 HepG2细胞的CYP1A和CYP3A的化学诱导  72
    5.2.5 大鼠原代肝细胞的CYP1A和CYP3A的化学诱导  72
    5.2.6 大鼠原代肝细胞的CYP1A和CYP3A的化学抑制  72
    5.2.7 GA(C17：1)在细胞中的体外孵育实验  72-73
    5.2.8 数据处理  73
  5.3 实验结果  73-79
    5.3.1 GA(C17：1)对HepG2细胞的毒性  73-75
    5.3.2 GA(C17：1)对大鼠原代肝细胞的毒性  75-77
    5.3.3 GA(C17：1)对L02细胞的毒性  77
    5.3.4 GA(C17：1)在大鼠原代肝细胞、HepG2和L02细胞中的代谢  77-79
  5.4 讨论  79-81
  5.5 本章小结  81-82
第六章 GA(C17：1)和GA(C15：1)在MDR1和BCRP转基因细胞上的转运研究  82-105
  6.1 实验仪器与材料  83
    6.1.1 仪器  83
    6.1.2 试剂与药品  83
    6.1.3 实验相关试药和试液配制  83
  6.2 实验方法  83-87
    6.2.1 常规细胞培养  83
    6.2.2 在透性支持物上接种细胞  83
    6.2.3 被动扩散标志物荧光黄(LY)跨膜通量的测定  83-84
    6.2.4 单层细胞跨膜电阻值的测定  84
    6.2.5 GA(C17：1)对MDCK和LLC-PK1系列细胞的毒性  84-85
    6.2.6 GA(C17：1)和GA(C15：1)在MDCK,MDCK-MDR1和MDCK-MDR1-CYP3A4细胞上的转运  85
    6.2.7 抑制剂对GA(C17：1)和GA(C15：1)转运的影响  85-86
    6.2.8 罗丹明123在MDCK和MDCK-MDR1细胞中的转运  86
    6.2.9 GA(C17：1)和GA(C15：1)对RhO123在MDCK、MDCK-MDR1细胞模型中转运的影响  86
    6.2.10 Rho123的含量测定方法  86
    6.2.11 数据处理  86-87
  6.3 实验结果  87-101
    6.3.1 分析方法学验证  87-90
    6.3.2 GA(C17：1)在MDCK和MDCK-MDR1细胞的毒性和转运研究  90-94
    6.3.3 抑制剂GA(C17：1)和GA(C15：1)在MDCK系列细胞转运的影响  94-96
    6.3.4 GA(C17：1)和GA(C15：1)对罗丹明细胞转运的影响  96-98
    6.3.5 GA(17：1)在LLC-PK1和LLC-PK1-BCRP细胞的毒性和转运研究  98-101
  6.4 讨论  101-104
    6.4.1 GA(C17：1)和GA(C15：1)与P-gp的相互作用  101-103
    6.4.2 GA(C17：1)和GA(C15：1)与BCRP的相互作用  103-104
    6.4.3 GA(C17：1)的细胞毒性  104
  6.5 本章小结  104-105
第七章 GA(17：1)在大鼠体内的药物动力学,组织分布和排泄研究  105-135
  7.1 实验仪器与材料  105-106
    7.1.1 仪器  105
    7.1.2 试剂与药品  105
    7.1.3 实验动物  105-106
    7.1.4 溶液配制  106
  7.2 实验方法  106-109
  7.3 分析方法学验证  109-119
    7.3.1 专属性  109-113
    7.3.2 线性范围和定量下限  113
    7.3.3 准确度和精密度  113-115
    7.3.4 提取回收率  115
    7.3.5 基质效应  115-117
    7.3.6 稳定性  117-119
  7.4 GA(C17：1)在大鼠体内药物动力学研究  119-120
  7.5 实验结果  120-132
    7.5.1 药物动力学研究  120-122
    7.5.2 组织分布研究  122
    7.5.3 排泄研究  122-123
    7.5.4 GA(C17：1)在大鼠体内的代谢产物初步分析  123-132
  7.6 讨论  132-134
  7.7 本章小结  134-135
第八章 银杏酸提取物在大鼠体内的药物动力学研究  135-154
  8.1 实验仪器与材料  135-137
    8.1.1 仪器  135
    8.1.2 试剂与药品  135
    8.1.3 实验动物  135-136
    8.1.4 溶液配制  136-137
  8.2 实验方法  137-138
    8.2.1 生物样品预处理  137
    8.2.2 LC-MS/MS分析方法  137-138
  8.3 分析方法学验证  138-144
    8.3.1 专属性  138-141
    8.3.2 线性范围和定量下限  141
    8.3.3 准确度和精密度  141-142
    8.3.4 提取回收率  142
    8.3.5 基质效应  142
    8.3.6 稳定性  142-144
  8.4 银杏酸提取物大鼠体内药物动力学及CsA的影响研究  144-145
    8.4.1 给药方案与药品采集  144-145
    8.4.2 生物样品测定  145
  8.5 实验结果  145-152
    8.5.1 银杏酸提取物中GA(C17：1)和GA(C15：1)的药物动力学  145-148
    8.5.2 环孢素A对GA(C15：1)和GA(C17：1)药物动力学的影响  148-151
    8.5.3 环孢素A对GA(C15：1)和GA(C17：1)脑组织分布的影响  151-152
  8.6 讨论  152-153
  8.7 本章小结  153-154
创新性  154-155
参考文献  155-172
作者简介  172

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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