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拆方肾气丸对肾阳虚雌鼠靶腺轴调控的实验及临床研究

作　者: 龙泳伶
导　师: 李政木
学　校: 广州中医药大学
专　业: 方剂学
关键词: 金匮肾气丸肾阳虚阴中求阳
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：动物实验：观察氢化可的松法所致肾阳虚雌性大鼠下丘脑一垂体—肾上腺轴(HPA轴)及下丘脑一垂体一卵巢轴(HPO轴)功能变化,探讨金匮肾气丸及其拆方所代表的不同补肾法(补肾阳、补肾阴、阴阳双补)对肾阳虚雌鼠HPA、HPO轴功能的改善情况,对其治疗肾阳虚的作用机制进行初步探讨,为中医“肾主生殖”及“阴中求阳”基本理论提供现代科学依据。临床研究：观察金匮肾气丸结合中医周期疗法对肾阳虚月经后期女性一般状况、月经状况、临床症状积分、基础体温(BBT)、生殖内分泌激素水平的改善情况,为临床治疗肾阳虚引起的月经后期及其他月经病、排卵障碍性不孕等生殖内分泌疾病提供依据。方法：动物实验：肾气丸“阴中求阳”配伍对肾阳虚雌性大鼠HPA、HPO轴调控的实验研究将“阴中求阳”代表方金匮肾气丸进行原方与拆方的配伍研究,分为正常组、模型组及拆方肾气丸各组：补阳组(附子、桂枝+茯苓、泽泻、丹皮)、补阴组(干地黄、山茱英、山药+茯苓、泽泻、丹皮)、阴阳双补组(即肾气丸全方组：附子、桂枝、干地黄、山茱英、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮)。将SPF级雌性SD大鼠55只,随机分为5组：正常组、模型组、补阳组、补阴组、阴阳双补组,每组11只。正常光照,自由摄食、饮水,适应性喂养1周。除正常组对照外,其余各组大鼠以氧化可的松法复制肾阳虚雌性大鼠模型：每¨日大腿内侧肌肉丰厚处消毒注射氢化可的松25mg／(kg·d),连续12天。造模后第13天开始灌胃给药,每天1次,连续干预15天。正常组、模型组按lml／100g体重灌服等体积生理盐水,每日一次,连续十预15天。造模第1天,灌胃第1天、第21天称量各组大鼠体重。造模第11天,灌胃第10天、第20天测量各组大鼠肛温。造模第12天、灌胃第20记录各组大鼠自主活动情况。造模第10天,灌胃第19天记录各组大鼠负重游泳时间。灌胃第21天上午麻醉大鼠,眼眶取血,静置,离心取上层血清冷藏待用。观察各组动物造膜前后、灌胃前后一般情况的改善,观察肾气丸各拆方组对氢化可的松所致肾阳虚型模型动物灌胃后体重、下丘脑、垂体、肾上腺重量,卵巢、子宫脏器重量指数,肛门温度,自主活动情况,抗疲劳试验(计算负重游泳时间)情况。采用光镜、酶联免疫分析、免疫组织化学分析、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法,对各组大鼠进行肾上腺、子宫内膜、卵巢组织的形态学及超微结构观察,计算各级卵泡总数、病理性囊性扩张卵泡总数,测定血清HPA轴(促肾上腺皮质激素ACTH、皮质醇COR)及HPO轴激素(卵泡刺激素FSH、黄体生成素LH、雌二醇E2、泌乳素PRL、孕酮P、睾酮T)水平,测定卵泡细胞凋亡途径相关因子(TNF-α肿瘤坏死因子-a、Bcl-2凋亡抑制基因、Bax促凋亡基因)表达、卵巢组织FSHRmRNA(卵泡刺激素受体mRNA)表达测定,探讨金匮肾气丸“阴中求阳”配伍结构对肾阳虚雌性大鼠HPA轴和HPO轴功能的调控。临床疗效观察：金匮肾气丸结合中医周期疗法对肾阳虚月经后期患者的疗效观察以中医辨证论治理论为指导,将临床收集的肾阳虚型月经后期女性患者给予金匮肾气丸口服治疗,同时结合中医周期疗法加减用药。采用病历跟踪、酶联免疫分析等方法,比较肾阳虚月经后期女性用药三个月前后一般状况,月经状况,基础体温(BBT),临床症状积分情况,血清内分泌激素水平：卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、泌乳素(PRL)、睾酮(T)等,观察金匮肾气丸配合中医周期疗法改善肾阳虚月经后期女性生殖机能的临床疗效及肾阳虚证候疗效情况,为临床治疗提供科学依据。结果：动物实验显示：1、通过对动物肛温、一般状况、自主活动情况等的观察,表明成功复制肾阳虚大鼠模型；2、肾阳虚雌性大鼠肛温下降,自主活动减少,负重游泳时间缩短,体重、下丘脑、垂体增重减慢,卵巢、子宫脏器指数增长减慢。金匮肾气丸各给药组(补阳组、补阴组、阴阳双补组)均能一定程度上改善肾阳虚模型大鼠-般状况、提升肛温、增加自主活动时间、增加负重游泳时间、增加体重及下丘脑、垂体、肾上腺重量、增加子宫、卵巢等脏器指数(P<O.01,P<O.05),而以阴阳双补组效果最为明显。3、肾阳虚雌性大鼠肾上腺、子宫内膜、卵巢等器官出现脏器萎缩等不同程度病理改变,超微结构异常。肾气丸及其补阳拆方、补阴拆方均能一定程度上抑制’肾阳虚模型雌性大鼠肾上腺、子宫、卵巢等器官萎缩状态,改善病理性脏器的形态,一定程度上修复造模药物引起的脏器超微结构异常,增加各级卵泡总数,减少病理性囊性扩展卵泡数,治疗效果以阴阳双补组最佳(P<O.01,P<O.05)。4、肾阳虚证与HPA、HPO轴功能的紊乱密切相关。肾阳虚雌性大鼠血清ACTH、COR、FSH、LH、E2、P水平显著降低(P<O.01,P<O.05),血清PRL、T水平显著升高(P<O.01,P<0.05)拆方肾气丸各治疗组均能一定程度上提升肾阳虚模型大鼠血清FSH、LH、E2、P水平(P<O.01,P<O.05),双补组效果最为显著,单一补阳组及补阴组效果不明显；拆方肾气丸各治疗组均能一定程度上降低肾阳虚模型大鼠血清PRL水平,双补组效果最为显著,单一补阳组及补阴组效果不明显。拆方肾气丸各组均未见能显著降低肾阳虚雌性大鼠血清T水平(P>0.05)。5、凋亡基因TNF-α、Bcl-2、Bax在卵泡的闭锁中起到重要的作用。肾阳虚雌性大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白Bc1-2表达明显降低(P<0.01), TNF-α、Bax表达明显升高(P<O.01,P<O.05)。拆方肾气丸各治疗组均能一定程度上升高Bcl-2表达水平(P<O.01,P<O.05),降低TNF-α、Bax表达水平(P<O.01,P<O.05),以双补组效果最为显著。6、肾阳虚雌性大鼠卵巢FSHRmRNA表达量明显低于正常组(P<O.01),拆方肾气丸各治疗组均能使肾阳虚证大鼠卵巢FSHRmRNA的表达量升高(P<0.01),以双补组最为明显。通过观察肾气丸各治疗组对‘肾阳虚雌性大鼠HPA、HPO轴的调控,对其治疗肾阳虚的作用机制进行初步探讨,为中医“肾主生殖”及“阴中求阳”基本理论提供实验依据。临床疗效观察显示：肾阳虚证与下丘脑-垂体-卵巢轴(HPO轴)功能的紊乱密切相关。金匮肾气丸配合中医周期疗法对肾阳虚月经后期患者的临床疗效总有效率为75%,肾阳虚证候疗效总有效率为75%,可明显降低肾阳虚型月经后期患者临床症状积分(P<O.01),明显改善BBT情况(P<O.01)。在对血清性激素水平影响中,可明显降低FSH、LH、T水平(P<O.01,P<O.05),升高E2(P<O.01)水平,从而改善患者月经情况。为临床治疗。肾阳虚引起的月经后期及其他月经病、排卵障碍性不孕等生殖内分泌疾病提供依据。结论：1、氢化可的松法所复制肾阳虚雌性大鼠呈现肛温下降,自主活动减少,抗疲劳能力减弱,体重及脏器增重减慢等一系列肾阳虚症状外,出现下HPA、HPO轴功能紊乱,相关激素水平含量异常；肾上腺、卵巢及子宫内膜组织形态和超微结构被破坏；卵巢颗粒细胞凋亡因子及卵泡刺激素受体mRNA表达异常,影响雌性大鼠卵巢功能。2、肾气丸“阴中求阳”配伍主要出大量补肾生精、滋补肝肾药物配伍少量温阳药物而成,以少火生气,微微生火达到阴生阳长、温补肾阳之效。金匮肾气丸及其拆方所代表的不同补肾法(补肾阳、补肾阴、阴阳双补法)均能不同程度改善肾阳虚雌性大鼠受损的卵巢功能,但单一的补阳法或补阴法效果不佳,阴阳双补法可提高疗效。纠正HPA、HPO轴激素水平紊乱,纠正细胞凋亡因子TNF-a、Bcl-2、Bax表达,增强卵巢颗粒细胞FSHRmRNA的表达,都可能是肾气丸“阴中求阳”治疗肾阳虚证的配伍机制。3、以中医辨证论治理论为指导,金匮肾气丸结合中医周期疗法在治疗肾阳虚月经后期中起到良好疗效。温补肾阳名方配合中医周期疗法可以发挥整体调节之优势,改善卵巢机能微环境,重建生殖内分泌的生理平衡,达到调经种子之功效。

全文目录

摘要  3-7
Abstract  7-17
引言  17-19
第一章文献研究  19-42
  第一节 “阴中求阳”理论的研究  19-24
    一、“阴中求阳”理论在中医阴阳学说中的科学内涵及重要意义  19-20
    二、“阴中求阳”理论在遣方用药中的体现  20-21
    三、“阴中求阳”理论的实验研究  21-22
    四、“阴中求阳”理论的临床应用  22-24
  第二节肾气丸的研究概况  24-29
    一、肾气丸是中医学“阴中求阳”方剂配伍理论的重要代表方  24-25
    二、肾气丸的实验药理研究  25-26
    三、肾气丸的临床运用研究  26-29
  第三节肾阳虚证的研究  29-33
    一、肾阳虚证理论的形成与发展沿革  29
    二、建国以来对肾虚证的量化标准研究  29-30
    三、肾阳虚证的现代医学研究进展  30-33
  第四节女性生殖机能的相关研究  33-41
    一、中医理论对肾与女性生殖机能关系的认识  33
    二、现代医学对妇女生殖机能调控相关理论的研究  33-38
    三、补肾中药调节女性生殖机能的实验研究概况  38-40
    四、温肾助阳中药调节女性生殖机能的临床研究概况  40-41
  第五节总结及研究假设  41-42
第二章实验研究  42-77
  第六节金匮肾气丸及其拆方对肾阳虚雌性大鼠应激性试验的影响  42-50
    一、材料与方法  42-44
    二、结果与分析  44-50
  第七节金匮肾气丸及其拆方对肾阳虚雌性大鼠脏器组织形态态学的影响  50-54
    一、材料与方法  50
    二、实验步骤  50-52
    三、结果与分析  52-54
  第八节金匮肾气丸及其拆方对肾阳虚雌性大鼠HPA轴相关因子的影响  54-57
    一、材料与方法  54-55
    二、结果与分析  55-57
  第九节金匮肾气丸及其拆方对肾阳虚雌性大鼠HPO轴相关因子的影响  57-63
    一、材料与方法  57
    二、结果与分析  57-63
  第十节金匮肾气丸及其拆方对肾阳虚雌性大鼠卵泡细胞凋亡途径相关因子的影响  63-71
    一、金匮肾气丸及其拆方对肾阳虚雌性大鼠血清肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响  63-64
    二、金匮肾气丸及其拆方对肾阳虚雌性大鼠Bcl-2、Bax蛋白的影响  64-71
  第十一节金匮肾气丸及其拆方对肾阳虚雌性大鼠卵巢FSHRmRNA表达的影响  71-77
    一、材料与方法  71
    二、实验步骤  71-74
    三、结果及分析  74-77
第三章临床研究  77-88
  第十二节金匮肾气丸结合中医周期疗法对肾阳虚月经后期患者的疗效观察  77-88
    一、研究目的及立体依据  77-78
    二、临床资料  78-84
    三、结果及分析  84-88
第四章讨论  88-98
  一、金匮肾气丸的组方配伍规律及药理药效  89-91
  二、氢化可的松法复制肾阳虚大鼠模型的选择  91-92
  三、实验室检测指标的选择  92
  四、临床研究中的治疗方案选择  92-94
  五、研究结果分析  94-98
结语  98-100
  一、结论  98
  二、创新点  98
  三、不足与展望  98-100
参考文献  100-105
附录  105
附录Ⅰ：计算公式及试剂盒操作步骤  105-107
附录Ⅱ：HE染色实验附图  107-114
附录Ⅲ：免疫组化实验附图  114-118
附录Ⅳ：临床观察记录表  118-119
附录Ⅴ：在校期间公开发表的论文及参与科研情况  119-120
致谢  120-121
统计学证明  121

拆方肾气丸对肾阳虚雌鼠靶腺轴调控的实验及临床研究

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