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降糖三黄片对IL-1β刺激下大鼠胰岛细胞凋亡机理的研究

作　者: 韩蕊
导　师: 朱章志
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中医学
关键词: 胰岛炎症细胞因子白介素-1β 降糖三黄片2号 iNOS caspase-3
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：通过研究不同剂量的降糖三黄片2号对体外原代培养大鼠胰岛细胞凋亡的影响,探讨降糖三黄片2号治疗和改善胰岛细胞凋亡的作用机制,进一步揭示降糖三黄片2号改善胰岛细胞凋亡的作用途径。方法：通过胆总管逆流灌注胶原酶V、原位消化及Ficoll-400梯度分层法分离纯化大鼠胰岛细胞,MTT法检测不同浓度降糖三黄片2号对IL-1β刺激下胰岛细胞活性影响筛选出有效浓度范围,使用NO检测试剂盒测定降糖三黄片2号对IL-1β刺激下胰岛细胞培养液中NO含量变化,同时RT-PCR检测降糖三黄片2号对IL-1β刺激下胰岛细胞内iNOS、caspase-3表达的影响,Western Blot检测IL-1β刺激下iNOS与P38、JNK的表达。结果：1.采用胆总管逆流灌注、原位消化及Ficoll-400梯度分层法,可以制备出形态、功能较好的原代大鼠胰岛细胞。2.通过MTT比色法筛选出降糖三黄片的有效药物浓度范围,其低、中、高剂量分别确定为50μg/ml、100μg/ml及200μg/ml。3.IL-1β作用胰岛细胞24h后,PT-PCR检测胰岛细胞培养液发现NO含量明显升高,同时RT-PCR也发现胰岛细胞内iNOS、caspase-3随之相应升高,提示IL-1β可上调胰岛细胞iNOS表达,合成过多的N0,引起caspse-3表达增加,最终导致凋亡增多,Western Blot发现iNOS表达的增加与MAPK家族中P38、JNK的增多密切相关。4.降糖三黄片可作用于NO依赖途径,抑制炎症(IL-1β)介导的胰岛β细胞凋亡,但作用效果呈浓度依赖性。结论：降糖三黄片2号可以减轻炎症(IL-1β)诱导的胰岛β细胞凋亡,其机制与其下调iNOS.减少NO的合成及抑制caspase-3的表达有关。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-9
引言  9-11
第一章文献综述  11-32
  1.1 炎症、IL-1β与糖尿病  11-16
    1.1.1 胰岛β细胞炎症与Ⅰ型糖尿病的发病  12
    1.1.2 白介素-1β与1型DM胰岛β细胞损伤  12
    1.1.3 胰岛β细胞炎症与Ⅱ型糖尿病的发生  12-14
    1.1.4 Ⅱ型糖尿病胰岛炎症产生白介素-1β  14-16
  1.2 IL-1β对β细胞的生物学效应  16-21
    1.2.1 影响β细胞胰岛素的合成与分泌  16
    1.2.2 诱导β细胞死亡  16-17
    1.2.3 IL-1β介导的β细胞信号通路  17-19
    1.2.4 β细胞凋亡  19-21
  1.3 中医与β细胞凋亡  21-26
    1.3.1 消渴病的病因  21-23
    1.3.2 消渴病的中医病机  23
    1.3.3 各时代消渴病的中医治法  23-24
    1.3.4 现代中医学对消渴炎症认识  24-25
    1.3.5 现代中医学对胰岛β细胞损伤的认识及研究  25-26
  1.4 加味桃核承气汤防治糖尿病及并发症研究综述  26-32
    1.4.1 加味桃核承气汤早期降糖机理研究  26-27
    1.4.2 加味桃核承气汤(降糖三黄片/三黄降糖片)拓展应用  27-30
    1.4.3 加味桃核承气汤(降糖三黄片/三黄降糖片)降糖机理拓展  30-32
第二章大鼠胰岛细胞分离、纯化及功能检测  32-40
  2.1 实验材料  32-33
    2.1.1 实验动物  32
    2.1.2 主要试验试剂  32
    2.1.3 主要试验试剂配制  32-33
  2.2 实验方法  33-35
    2.2.1 SD大鼠胰岛分离、纯化及培养  33-34
    2.2.2 胰岛素释放检测  34-35
  2.3 实验结果  35-37
    2.3.1 分离后胰岛的形态特征  35
    2.3.2 胰岛细胞功能鉴定  35-37
  2.4 分析与讨论  37-40
第三章 MTT法检测不同剂量药物对IL-1β刺激下胰岛细胞增殖抑制率  40-47
  3.1 实验材料  40
    3.1.1 实验动物  40
    3.1.2 实验药品  40
    3.1.3 主要试剂  40
    3.1.4 主要仪器  40
  3.2 实验原理  40
  3.3 实验步骤  40-42
    3.3.1 胰岛细胞制备  40-41
    3.3.2 药物萃取  41
    3.3.3 MTT比色法  41-42
  3.4 实验结果  42-44
    3.4.1 MTT筛选药物浓度  42
    3.4.2 MTT检测筛选后的药物浓度对IL-1β刺激下胰岛细胞活性的影响  42-44
  3.5 分析与讨论  44-47
第四章降糖三黄片对IL-1β刺激下胰岛细胞培养液中NO含量及胰岛细胞中caspase-3mRNA、iNOSmRNA表达的影响  47-61
  4.1 实验材料  47
    4.1.1 实验仪器  47
    4.1.2 主要试剂  47
  4.2 实验步骤  47-49
    4.2.1 样品制备  47-48
    4.2.2 检测胰岛细胞培养液中NO含量  48
    4.2.3 胰岛细胞总RNA的抽提--Trizol法(细胞裂解、RNA沉淀、洗涤、RNA再溶解)  48
    4.2.4 RT-PCR法检测胰岛细胞中caspase-3mRNA、iNOS-mRNA的表达  48-49
  4.3 实验结果  49-59
    4.3.1 胰岛细胞培养液中NO结果  49-52
    4.3.2 RT-PCR检测结果  52-59
  4.4 分析与讨论  59-61
第五章 Western Blot法检测降糖三黄片对IL-1β刺激下胰岛细胞iNOS蛋白表达及P38、JNK信号通路的影响  61-67
  5.1 实验材料  61
    5.1.1 主要试剂  61
    5.1.2 主要配方  61
  5.2 实验步骤  61-63
    5.2.1 样品制备及分组  61-62
    5.2.2 制备蛋白提取液  62
    5.2.3 BCA法测定蛋白质浓度  62-63
    5.2.4 SDS-聚丙烯胺凝胶(SDS-PAGE)电泳  63
    5.2.5 转膜及封闭  63
    5.2.6 杂交、显色  63
    5.2.7 统计分析  63
  5.3 实验结果  63-65
  5.4 讨论  65-67
    5.4.1 实验结果讨论  65
    5.4.2 中医讨论  65-67
结语  67-68
参考文献  68-78
附录  78-81
在校期间发表论文情况  81-82
致谢  82

降糖三黄片对IL-1β刺激下大鼠胰岛细胞凋亡机理的研究

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