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降糖三黄片对IL-1β刺激下大鼠胰岛细胞凋亡机理的研究
作 者: 韩蕊
导 师: 朱章志
学 校: 广州中医药大学
专 业: 中医学
关键词: 胰岛炎症 细胞因子白介素-1β 降糖三黄片2号 iNOS caspase-3
分类号: R285.5
类 型: 博士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
目的:通过研究不同剂量的降糖三黄片2号对体外原代培养大鼠胰岛细胞凋亡的影响,探讨降糖三黄片2号治疗和改善胰岛细胞凋亡的作用机制,进一步揭示降糖三黄片2号改善胰岛细胞凋亡的作用途径。方法:通过胆总管逆流灌注胶原酶V、原位消化及Ficoll-400梯度分层法分离纯化大鼠胰岛细胞,MTT法检测不同浓度降糖三黄片2号对IL-1β刺激下胰岛细胞活性影响筛选出有效浓度范围,使用NO检测试剂盒测定降糖三黄片2号对IL-1β刺激下胰岛细胞培养液中NO含量变化,同时RT-PCR检测降糖三黄片2号对IL-1β刺激下胰岛细胞内iNOS、caspase-3表达的影响,Western Blot检测IL-1β刺激下iNOS与P38、JNK的表达。结果:1.采用胆总管逆流灌注、原位消化及Ficoll-400梯度分层法,可以制备出形态、功能较好的原代大鼠胰岛细胞。2.通过MTT比色法筛选出降糖三黄片的有效药物浓度范围,其低、中、高剂量分别确定为50μg/ml、100μg/ml及200μg/ml。3.IL-1β作用胰岛细胞24h后,PT-PCR检测胰岛细胞培养液发现NO含量明显升高,同时RT-PCR也发现胰岛细胞内iNOS、caspase-3随之相应升高,提示IL-1β可上调胰岛细胞iNOS表达,合成过多的N0,引起caspse-3表达增加,最终导致凋亡增多,Western Blot发现iNOS表达的增加与MAPK家族中P38、JNK的增多密切相关。4.降糖三黄片可作用于NO依赖途径,抑制炎症(IL-1β)介导的胰岛β细胞凋亡,但作用效果呈浓度依赖性。结论:降糖三黄片2号可以减轻炎症(IL-1β)诱导的胰岛β细胞凋亡,其机制与其下调iNOS.减少NO的合成及抑制caspase-3的表达有关。
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全文目录
摘要 3-4 Abstract 4-6 目录 6-9 引言 9-11 第一章 文献综述 11-32 1.1 炎症、IL-1β与糖尿病 11-16 1.1.1 胰岛β细胞炎症与Ⅰ型糖尿病的发病 12 1.1.2 白介素-1β与1型DM胰岛β细胞损伤 12 1.1.3 胰岛β细胞炎症与Ⅱ型糖尿病的发生 12-14 1.1.4 Ⅱ型糖尿病胰岛炎症产生白介素-1β 14-16 1.2 IL-1β对β细胞的生物学效应 16-21 1.2.1 影响β细胞胰岛素的合成与分泌 16 1.2.2 诱导β细胞死亡 16-17 1.2.3 IL-1β介导的β细胞信号通路 17-19 1.2.4 β细胞凋亡 19-21 1.3 中医与β细胞凋亡 21-26 1.3.1 消渴病的病因 21-23 1.3.2 消渴病的中医病机 23 1.3.3 各时代消渴病的中医治法 23-24 1.3.4 现代中医学对消渴炎症认识 24-25 1.3.5 现代中医学对胰岛β细胞损伤的认识及研究 25-26 1.4 加味桃核承气汤防治糖尿病及并发症研究综述 26-32 1.4.1 加味桃核承气汤早期降糖机理研究 26-27 1.4.2 加味桃核承气汤(降糖三黄片/三黄降糖片)拓展应用 27-30 1.4.3 加味桃核承气汤(降糖三黄片/三黄降糖片)降糖机理拓展 30-32 第二章 大鼠胰岛细胞分离、纯化及功能检测 32-40 2.1 实验材料 32-33 2.1.1 实验动物 32 2.1.2 主要试验试剂 32 2.1.3 主要试验试剂配制 32-33 2.2 实验方法 33-35 2.2.1 SD大鼠胰岛分离、纯化及培养 33-34 2.2.2 胰岛素释放检测 34-35 2.3 实验结果 35-37 2.3.1 分离后胰岛的形态特征 35 2.3.2 胰岛细胞功能鉴定 35-37 2.4 分析与讨论 37-40 第三章 MTT法检测不同剂量药物对IL-1β刺激下胰岛细胞增殖抑制率 40-47 3.1 实验材料 40 3.1.1 实验动物 40 3.1.2 实验药品 40 3.1.3 主要试剂 40 3.1.4 主要仪器 40 3.2 实验原理 40 3.3 实验步骤 40-42 3.3.1 胰岛细胞制备 40-41 3.3.2 药物萃取 41 3.3.3 MTT比色法 41-42 3.4 实验结果 42-44 3.4.1 MTT筛选药物浓度 42 3.4.2 MTT检测筛选后的药物浓度对IL-1β刺激下胰岛细胞活性的影响 42-44 3.5 分析与讨论 44-47 第四章 降糖三黄片对IL-1β刺激下胰岛细胞培养液中NO含量及胰岛细胞中caspase-3mRNA、iNOSmRNA表达的影响 47-61 4.1 实验材料 47 4.1.1 实验仪器 47 4.1.2 主要试剂 47 4.2 实验步骤 47-49 4.2.1 样品制备 47-48 4.2.2 检测胰岛细胞培养液中NO含量 48 4.2.3 胰岛细胞总RNA的抽提--Trizol法(细胞裂解、RNA沉淀、洗涤、RNA再溶解) 48 4.2.4 RT-PCR法检测胰岛细胞中caspase-3mRNA、iNOS-mRNA的表达 48-49 4.3 实验结果 49-59 4.3.1 胰岛细胞培养液中NO结果 49-52 4.3.2 RT-PCR检测结果 52-59 4.4 分析与讨论 59-61 第五章 Western Blot法检测降糖三黄片对IL-1β刺激下胰岛细胞iNOS蛋白表达及P38、JNK信号通路的影响 61-67 5.1 实验材料 61 5.1.1 主要试剂 61 5.1.2 主要配方 61 5.2 实验步骤 61-63 5.2.1 样品制备及分组 61-62 5.2.2 制备蛋白提取液 62 5.2.3 BCA法测定蛋白质浓度 62-63 5.2.4 SDS-聚丙烯胺凝胶(SDS-PAGE)电泳 63 5.2.5 转膜及封闭 63 5.2.6 杂交、显色 63 5.2.7 统计分析 63 5.3 实验结果 63-65 5.4 讨论 65-67 5.4.1 实验结果讨论 65 5.4.2 中医讨论 65-67 结语 67-68 参考文献 68-78 附录 78-81 在校期间发表论文情况 81-82 致谢 82
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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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