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益气解毒法对大鼠肝干细胞增殖及肝脏再生影响的机制研究

作　者: 李鸣
导　师: 赵映前
学　校: 湖北中医药大学
专　业: 中医临床基础
关键词: 益气解毒肝干细胞大鼠调控机理
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

1.目的西洋参、牛黄具有益气养阴、清热解毒之功效,符合“益气解毒法”的基本原则。将两药有效成分配伍组合,观察“益气解毒法”对大鼠肝干细胞系诱导分化,增殖的影响和对大鼠肝再生的效果,探索益气解毒法治疗慢性肝病的作用原理,为进一步研究治则治法提供新思路,也为临床推广应用提供理论与实验依据。2.方法2.1分组正常组,手术组(不灌服2-AAF),模型组,中药水煎组5%组、10%组、20%组,中药成分组5%组、10%组、20%组。2.2造模选常用的solt-Farbar造模方法,稍作改进。随机分组分笼饲养1周后,胃管灌服2-AAF(按10mg/kg鼠重),每日1次,连续4d,第5日戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉下行肝三分之二(左叶和中叶)切除(当日停灌2-AAF),肝叶切除方法,仰卧固定,常规备皮消毒,取上腹正中切口入腹,游离左叶和中叶动脉、结扎,待左、中叶肝颜色变黄,切除左叶和中叶,结扎动脉、静脉和胆管,无出血、胆瘘关腹。手术当天不给药。第6日连续灌服2-AAF1周,再分别中药灌服(剂量为整体模型动物的有效剂量),并设正常对照组,对照组给予生理盐水灌喂。于手术后第13、16、20、25天分别取3只大鼠,戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,打开腹腔,暴露肝脏,无菌腹主动脉采血,分离血清置-30℃保存待检。迅速剪取肝脏10-20g快速液氮冷冻过夜后置于-80℃冷存备检,并取再生肝组织和右叶肝,10%甲醛浓度固定,常规石蜡包埋,5umm连续切片备用。2.3观察指标的检测肝干细胞(卵圆细胞)增殖情况：肝卵圆细胞核运用计算机图像分析系统进行卵圆细胞、肝细胞标志物计数定量分析比较。原位杂交法检测肝组织TGF-α、TGF-β1mRNA表达：制备TGF-α RNA和TGF-α RNA探针,TGF-α采用DNA-RNA原位杂交法,TGF-β1采用RNA-RNA杂交法,按试剂盒说明操作。肝组织TGF-β1定量检测：取0.1g液氮冻存肝组织匀浆,提取总RNA,运用RT-PCR联合DotBlot法定量检测TGF-β1。再生肝细胞分裂指数(MI)：取再生肝组织10%甲醛固定,常规石蜡包埋,苏木素-伊红染色,油镜下观察计数肝细胞核总数和肝细胞核分裂数,以下公式计算：MI%=肝细胞核有丝分裂象(个)/肝细胞核总数(个)x100%。肝组织EGFR、TGF-βR2、HGFR受体蛋白的表达：取肝组织5um连续切片,采用SABC免疫组织化学法检测上述受体,用已知的EGFR、TGF-β R2、HGFR阳性大鼠肝组织作阳性对照,用PBS代替一抗作空白阴性对照。一般指标的观察：如大鼠体重、毛发、粪便、分泌物、活动状况等,血肝功能生化检测,肝组织切片组织学观察。3.结果3.1成分组与水煎组PCNA、波形蛋白、肝细胞CK8、CK18表达均大于手术组与正常组(P<0.05),表明成功建立了肝卵圆细胞模型。3.2成分组与水煎组TGF-β1表达均大于模型组与手术组(P<0.05),表明益气解毒法能通过TGF-β1干预了肝干细胞诱导分化。3.3成分组与水煎组TGF-α、TGF-β1mRNA表达均优于模型组与手术组(P<0.05),表明益气解毒法能通过TGF-α、TGF-β1mRNA干预了肝干细胞诱导分化。3.4成分组与水煎组EGFR、TGF-βR2、HGFR受体蛋白表达均优于模型组与手术组(P<0.05),表明益气解毒法能通过EGFR、TGF-βR2、HGFR受体蛋白干预了肝干细胞诱导分化。3.5成分组与水煎组在改善大鼠一般情况方面均优于模型组与手术组(P<0.05),表明益气解毒法能调节肝干细胞诱导分化。4、结论4.1.2-AAF联合肝损伤较单纯肝损伤造模方法好,大鼠死亡率低。4.2.益气解毒法能通过调节TGF-β1干预肝干细胞诱导、增值和分化。4.3.益气解毒法能通过调节TGF-a、TGF-β1mRNA干预肝干细胞诱导、增值和分化。4.4.益气解毒法能通过调节EGFR、TGF-βR2、HGFR干预肝干细胞诱导、增值和分化。4.5.益气解毒法能改善大鼠一般情况,提高其生存质量,改善其肝功能。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-12
英文缩略词表  12-13
前言  13-17
一：大鼠肝干细胞增殖的研究  17-31
  1. 材料  17
  2. 方法及步骤  17-21
  3. 指标检测  21
  4. 数据处理  21
  5. 结果  21-28
  6. 讨论  28-30
  7. 结论  30-31
二：益气解毒法对肝组织TGF-β1表达的影响  31-40
  1. 材料  31
  2. 方法及步骤  31-36
  3. 数据处理  36
  4. 结果  36-37
  5. 讨论  37-39
  6. 结论  39-40
三：益气解毒法对肝组织TGF-α、TGF-β1mRNA表达的影响  40-50
  1. 材料  40-41
  2. 方法及步骤  41-44
  3. 数据处理  44
  4. 结果  44-47
  5. 讨论  47-49
  6. 结论  49-50
四：益气解毒法对肝组织EGFR、TGF-βR2、HGFR受体蛋白表达的影响  50-66
  1. 材料  50
  2. 方法及步骤  50-54
  3. 指标检测  54
  4. 数据处理  54
  5. 结果  54-59
  6. 讨论  59-64
  7. 结论  64-66
五：益气解毒法对大鼠一般情况的影响  66-71
  1. 材料  66
  2. 方法及步骤  66-67
  3. 数据处理  67
  4. 结果  67-68
  5. 讨论  68-70
  6. 结论  70-71
六、张仲景对肝病的认识与治疗  71-83
  (一) 气虚毒蕴是慢性乙型肝炎的主要病理基础  71-75
  (二) 益气养阴、清热解毒是治疗慢性乙肝的重要治法  75-76
  (三) 张仲景对肝病的认识与治疗  76-79
  (四) 组方中药分析  79-83
七、卵圆细胞和肝干细胞相互关系  83-87
参考文献  87-95
文献综述  95-110
  参考文献  106-110
致谢  110

益气解毒法对大鼠肝干细胞增殖及肝脏再生影响的机制研究

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