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肾络通对梗阻性肾病大鼠氧化应激和细胞凋亡的影响

作　者: 王蕊
导　师: 许庆友
学　校: 河北医科大学
专　业: 中医诊断学
关键词: 中药肾间质纤维化氧化应激细胞凋亡 Caspase-12 Caspase-9 Bcl-2 Bax
分类号: R277.5
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

梗阻性肾病是因尿液排出障碍引发的肾脏结构和功能损伤的泌尿外科常见疾病，其典型病理改变为炎性细胞浸润、细胞增殖与凋亡、胶原成分异常沉积及肾间质纤维化。目前临床上对梗阻性肾病的治疗主要为解除梗阻，恢复尿路通畅，但是很多患者在梗阻因素解除后肾功能仍不能恢复，甚至继续恶化，因此，研究梗阻性肾病的发病机制可为临床治疗提供理论依据。最近的研究表明，梗阻性肾病与氧自由基引起的氧化应激和肾小管上皮细胞凋亡有密切联系。梗阻造成肾积水继而肾盂内压力升高，引发肾脏血流动力学改变。肾小管血供减少诱发肾小管上皮细胞缺血缺氧性坏死和细胞凋亡，同时缺氧导致大量氧自由基释放，进一步加重肾小管上皮细胞的氧化损伤；肾血流量的减少还可导致肾小球滤过率下降和肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone, RAAS)激活，该系统激活后产生大量氧自由基和核因子-κB(Nuclear factor-κＢ, NF-κＢ)，诱导促凋亡信号释放，导致肾小管上皮细胞凋亡。实验研究证实应用抗氧化药物可减轻肾脏氧化损伤、抑制肾小管上皮细胞凋亡，改善肾脏功能，说明氧化应激可能参与了细胞凋亡进程。此外，梗阻介导的缺血性氧化损伤诱发肾小管上皮细胞凋亡可能与多种促凋亡通路密切相关。本次实验针对UUO(Unilateral ureteral obstruction单侧输尿管结扎)模型中氧化应激与细胞凋亡可能相关机制，给予特异性抗氧化剂Tempol治疗，同时给予化瘀通络方肾络通，观察MDA、8-OhdG、8-iso-PGF2α等氧化损伤指标及Caspase-12、caspase-9、Bcl-2、Bax等凋亡相关因子的表达，初步探讨中药对梗阻性肾病大鼠氧化应激和细胞凋亡的保护作用及作用机制。第一部分肾络通对梗阻性肾病大鼠氧化损伤和肾脏组织病理形态学的影响方法：实验动物自由进食和饮水，温度条件控制在(22±2)℃。适应性饲养1WK后，48只Wistar大鼠随机分为假手术组（Sham group）、UUO组(UUO group)、Tempol组(Tempol group)、肾络通组(SLT group)，每组12只。各组大鼠10%水合氯醛注射后，于左侧中腹部切开皮肤，游离左侧输尿管，分别在输尿管上1/3处和中1/3处用丝线结扎，切断输尿管，逐层缝合皮肤。假手术组仅将输尿管游离但不结扎离断。术后第10天肾脏明显肿大，输尿管扩张，肾盂明显积水，模型复制成功。术后开始给药，Tempol组以Tempol30mg/(kg·d)入水瓶(避光)自由饮用；肾络通组给予肾络通煎剂26g/(kg·d)入水瓶饮用，假手术组及UUO组给予等容量生理盐水饮用，均每天1次。实验动物入代谢笼收集尿液，备检。连续干预10天。10天后，各组大鼠称重后断头处死，留取血液标本，备检；切取梗阻侧肾脏，除去被膜后称重，部分肾组织置于4％多聚甲醛固定，行HE、Masson染色。采用SPSS13.0for windows统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间比较采用LSD-t检验。所有假设检验方法均以0.05和0.01为显著性水平标准。结果：1各组大鼠肾组织病理形态学改变HE染色显示，假手术组有少量炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞排列整齐；UUO组肾间质大量炎性细胞浸润，肾小管明显扩张，上皮细胞变性、浊肿、坏死、脱落；Tempol组及肾络通组亦可见肾小管扩张及上皮细胞变性坏死等，但炎性细胞浸润明显减少。Masson染色显示，假手术组可见少量胶原成分表达，主要位于肾小球/肾小管基底膜及肾间质；UUO组肾脏结构紊乱，胶原成分显著增多，以肾间质为主；Tempol组及肾络通组胶原纤维表达较假手术组增多，但与UUO组相比则明显减少。PAS染色显示，UUO组肾小球基底膜明显增厚，肾小球内糖原沉积增多，肾间质大量炎性细胞浸润，肾小管部分萎缩，管腔闭塞或扩张，肾间质变宽。假手术组无上述改变，Tempol组及肾络通组肾小球糖原沉积减少，可见或多或少炎性细胞浸润，肾小球基底膜轻度增厚，肾小管扩张，但较UUO组减轻。2各组大鼠血清MDA和血清、尿液8-OhdG及8-iso-PGF2α水平比较与假手术组比较，UUO组血清MDA和血清、尿液8-OHdG含量均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)；与UUO组比较，Tempol组及肾络通组血清MDA和血清、尿液8-OhdG含量下降，差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)。与假手术组比较，UUO组尿液8-iso-PGF2α含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与UUO组比较，Tempol组及肾络通组尿液8-iso-PGF2α含量下降，差异有统计学意义(P<0.01)。与假手术组比较，UUO组血清8-iso-PGF2α含量有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与UUO组比较，Tempol组及肾络通组尿液8-iso-PGF2α含量有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。第二部分肾络通对梗阻性肾病大鼠细胞凋亡的影响方法：动物分组、模型复制、给药方法同第一部分，共10天。实验结束时留取肾脏标本，部分肾组织置于4％多聚甲醛固定，用于光镜和TUNEL检测细胞凋亡。统计学方法同第一部分。结果：1光镜观察肾脏细胞凋亡1000倍油镜下可观察到UUO组大鼠肾脏细胞凋亡，细胞核染成紫蓝色，细胞核形态发生改变，表现为核浓缩、核裂解。2TUNEL法检测肾脏细胞凋亡假手术组可见少量阳性细胞，UUO组阳性凋亡细胞显著增多(P<0.01)；与UUO组比较，Tempol组及肾络通组阳性细胞数明显减少(P<0.05)，其中Tempol组下降稍明显，但与肾络通组比较无统计学意义。第三部分肾络通对梗阻性肾病大鼠细胞凋亡Caspase通路的影响方法：动物分组、模型复制、给药方法同第一部分，共10天。实验结束时切取梗阻侧肾脏，部分肾组织4％多聚甲醛固定用于免疫组化，部分肾组织-70℃保存用于提取蛋白。统计学方法同第一部分。结果：1免疫组化检测Caspase12、Caspase9的表达假手术组caspase12呈弱表达；UUO组表达明显增强，其中以髓质扩张的肾小管上皮细胞胞浆表达最为显著；Tempol组及肾络通组亦可见到阳性表达，呈局部中度表达，但较UUO组明显减弱。假手术组caspase9呈弱表达，主要表达于肾小管上皮细胞胞浆；UUO组表达明显增强，主要表达于肾小管上皮细胞胞浆，部分附着于细胞膜，呈棕黄色或棕褐色颗粒；Tempol组及肾络通组亦可见Caspase9阳性表达，较假手术组为甚，但与UUO组比较则明显减轻。2Western Blot检测Caspase12、Caspase9蛋白表达与假手术组比较，UUO组caspase12, caspase9蛋白表达明显上调；与UUO组比较，Tempol组及肾络通组其表达均被下调；与Tempol组相比，肾络通组caspase9未见明显差异，但caspase12有显著性差异。第四部分肾络通对梗阻性肾病大鼠细胞凋亡因子Bcl-2、BaX表达的影响方法：动物分组、模型复制、给药方法同第一部分，共10天。实验结束时切取梗阻侧肾脏，部分肾组织4％多聚甲醛固定用于免疫组化，部分肾组织-70℃保存用于提取mRNA及蛋白。统计学方法同第一部分。结果：1Real-time PCR检测Bcl-2、Bax及Bax/Bcl-2mRNA表达与假手术组比较，UUO组中Bax及Bax/Bcl-2mRNA表达上调，Bcl-2mRNA表达下调，差异有统计学意义(P<0.01)。与UUO组比较，Tempol组及肾络通组Bax及Bax/Bcl-2mRNA表达显著下调，而Bcl-2mRNA表达上调，其中以Tempol组作用更为明显，差异有统计学意义(P<0.01)。2免疫组化检测肾组织Bcl-2、Bax表达假手术组可见Bcl-2阳性表达，主要表达于肾小管和皮髓交界处，肾间质也可见少量表达，呈棕黄色或棕褐色颗粒；UUO组其表达明显下降，主要表达于近曲小管；与UUO组比较，Tempol组及肾络通组Bcl-2表达明显增强。假手术组可见Bax阳性表达，主要表达于肾小管上皮细胞胞浆，呈棕黄色或棕褐色颗粒；与假手术组比较，UUO组其表达明显增强，主要表达于肾小管上皮细胞胞浆；与UUO组比较，Tempol组及肾络通组Bax表达明显下降。3Western Blot检测肾组织Bcl-2、Bax蛋白表达与假手术组比较，UUO组大鼠Bax表达上调，Bcl-2表达下调，差异有统计学意义(P<0.01)。与UUO组比较，Tempol组及肾络通组大鼠Bax表达显著下调，而Bcl-2表达上调，其中以Tempol组作用更为明显，差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)。结论：1采用单侧输尿管结扎复制梗阻性肾病肾间质纤维化动物模型，肾脏病理显示大量炎性细胞浸润、输尿管扩张明显及胶原成分大量沉积。肾络通可改善UUO大鼠肾组织间质纤维化病理损伤程度。2肾络通可下调MDA、8-OhdG、8-iso-PGF2α等氧化损伤指标的表达，改善UUO大鼠氧化应激状态，起到一定的抗氧化损伤的作用。3肾络通可以通过抑制肾脏固有细胞过度凋亡，维持细胞凋亡和增殖之间的动态平衡，从而减轻UUO诱导的肾脏损伤，起到肾脏保护作用。4氧化应激通过激活Caspase家族上游效应介质Caspase-12及Caspase-9实现凋亡信号的启动和传导。肾络通可以通过下调Caspase-12、Caspase-9蛋白表达来抑制肾小管上皮细胞凋亡，从而发挥肾脏保护作用。5Bcl-2家族在细胞凋亡信号传导过程中发挥重要作用，其中Bcl-2为抑制凋亡因子，Bax为促进凋亡因子，两者共同调控细胞存亡。肾络通可以通过上调Bcl-2mRNA及蛋白表达，下调Bax mRNA蛋白表达，且下调Bax/Bcl-2mRNA表达，减少输尿管梗阻后肾小管上皮细胞凋亡，起到肾脏保护作用。

全文目录

摘要  5-10
ABSTRACT  10-17
英文缩写  17-18
引言  18-19
第一部分肾络通对梗阻性肾病大鼠氧化损伤和肾脏组织病理形态学的影响  19-40
  前言  19
  材料与方法  19-22
  结果  22-24
  附图  24-31
  附表  31-32
  讨论  32-36
  小结  36-37
  参考文献  37-40
第二部分肾络通对梗阻性肾病大鼠细胞凋亡的影响  40-56
  前言  40
  材料与方法  40-42
  结果  42-43
  附图  43-47
  附表  47-48
  讨论  48-52
  小结  52-53
  参考文献  53-56
第三部分肾络通对梗阻性肾病大鼠细胞凋亡 Caspase 通路的影响  56-78
  前言  56
  材料与方法  56-58
  结果  58-60
  附图  60-69
  附表  69-70
  讨论  70-74
  小结  74
  参考文献  74-78
第四部分肾络通对梗阻性肾病大鼠细胞凋亡因子 Bcl-2、Bax 表达的影响  78-94
  前言  78
  材料与方法  78-80
  结果  80-82
  附图  82-85
  附表  85-86
  讨论  86-89
  小结  89-90
  参考文献  90-94
结论  94-95
综述梗阻性肾病中关于氧化应激介导细胞凋亡的研究进展  95-106
  参考文献  100-106
致谢  106-107
个人简历  107-109

肾络通对梗阻性肾病大鼠氧化应激和细胞凋亡的影响

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