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枸杞醇提物及其成分叶黄素/玉米黄质在体内外对年龄相关性黄斑变性防治的研究

作　者: 黄冰林
导　师: 丁淑华
学　校: 南京中医药大学
专　业: 中医五官科学
关键词: 年龄相关性黄斑变性 半胱氨酸组织蛋白酶B 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 枸杞醇提物 基质金属蛋白激酶2 金属蛋白激酶组织抑制因子2 叶黄素 玉米黄质 氧化损伤
分类号: R275.9
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：体内实验,研究枸杞醇提物对高脂饮食及氢醌诱发的年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)模型小鼠视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)下沉积物和Bruch膜超微结构的影响,以及对模型小鼠的半胱氨酸组织蛋白酶B(cathepsin B, Cat B)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (cystatin C, Cys C) mRNA的转录和蛋白表达的影响；体外实验,探讨枸杞子的主要成分叶黄素和玉米黄质对过氧化氢(H2O2)诱导的人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞的基质金属蛋白激酶(matrix metalloproteinases, MMP)2和金属蛋白激酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMP)2蛋白表达的影响。方法：体内实验,选取8个月龄的雌性C57BL/6小鼠100只。按体重随机分5组,其中空白组、模型对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组,每组20只。空白组20只：正常饮食；余4组高脂饮食喂养6个月后,于饮水中加入氢醌(0.8%)继续饲养3个月；治疗组再予枸杞醇提物以灌胃法给药(高剂量组3.75g/kg/d、中剂量组2.50g/kg/d、低剂量组1.25g/kg/d),每日一次,继续持续3个月。观察期满处死动物,摘取眼球。电镜观察RPE下沉积物及Bruch膜；免疫组化观察Cat B、Cys C的表达;Real time-PCR检测Cat B、Cys C mRNA的表达；Western blot检测Cat B、Cys C蛋白的表达。体外实验,选用ARPE-19细胞常规培养后,细胞增殖活性的方法检测筛选H202及叶黄素和玉米黄质的最佳药物浓度,Western blot方法检测细胞中MMP-2, TIMP-2蛋白酶体表达水平。结果：体内实验,RPE下沉积物形成：模型对照组RPE下沉积物的形成与空白组相比明显增多(P<0.01),治疗组中：高剂量组与模型对照组相比有极明显减轻(P<0.01),中剂量组、低剂量组则有明显减轻(P<0.05)。Bruch膜厚度：模型对照组的Bruch膜厚度明显比空白组增厚(P<0.01),治疗各组的厚度则明显小于模型对照组(P<0.01)。Cat B、Cys C mRNA的表达：两者在模型对照组的表达显著高于空白组(P<0.01),治疗各组Cat B、Cys C mRNA的表达与模型对照组相比明显降低(P<0.01)。Cat B、Cys C的蛋白表达：Cat B蛋白在模型对照组的表达明显高于空白组(P<0.05),治疗组与模型对照组相比：高、中剂量组有显著降低(P<0.05),低剂量组无明显差异(P>0.05)；Cys C的蛋白表达在空白组与模型对照组相比有显著降低(P<0.05),治疗各组与模型对照组比均显著降低(P<0.01)。体内实验,浓度为1、10、100μmol/L的H202溶液与空白组(不加H202溶液的空白对照组)相比无明显统计学差异(P>0.05),浓度为200μmol/L的H202溶液存在统计学差异(P<0.05),浓度为300、400、500μmol/L的H202溶液则存在极显著性差异(P<0.01)。叶黄素及玉米黄质对ARPE-19细胞活性的影响：当药物浓度在1、10μmol/L时,与模型对照组相比无明显差异(P>0.05),浓度为30、50、70μmol/L时存在显著性差异(P<0.05),浓度为100μmol/L时存在极显著性差异(P<0.01)。MMP-2的蛋白表达：模型对照组MMP-2的蛋白较空白组有明显的高表达(P<0.05),药物浓度为30、50μmol/L时,MMP-2的蛋白表达与模型对照组比有显著性差异(P<0.05),当浓度到达70μmol/L时有极显著性差异(P<0.01)。TIMP-2的蛋白表达：模型对照组TIMP-2的蛋白较空白组有明显的高表达(P<0.05)。治疗组中当药物浓度为30μmol/L时TIMP-2的蛋白表达与模型对照组比并无统计学差异(P>0.05),浓度为50μmol/L时有统计学差异(P<0.05),浓度为70μmol/L时差异有极显著性(P<0.01)。结论：枸杞醇提物能下调Cat B、Cys C mRNA和蛋白的高表达。抑制高脂饮食和氢醌引起的模型小鼠RPE下沉积物形成及Bruch膜的增厚,机制可能与下调Cat B、Cys C的表达有关。枸杞子的主要成分叶黄素和玉米黄质对H202诱导的ARPE-19中的MMP-2、 TIMP-2蛋白酶体的高表达均有下调作用。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-13
前言  13-15
第一部分 理论部分  15-37
  1. 中医学对AMD的认识  15-18
    1.1 病名源流  15
    1.2 病因病机  15-17
    1.3 证候特征  17
    1.4 中医治疗  17-18
  2. 西医学对AMD的认识  18-27
    2.1 临床特点及分类  18-19
    2.2 病因  19-20
    2.3 发病机制  20-22
    2.4 治疗  22-27
      2.4.1 激光治疗  23-24
      2.4.2 放射治疗  24
      2.4.3 手术治疗  24
      2.4.4 药物治疗  24-26
      2.4.5 中西医结合治疗  26-27
  3. 枸杞子的相关研究  27-31
    3.1 化学成分  27-28
    3.2 生物活性  28-31
  参考文献  31-37
第二部分 实验研究—-体内实验  37-67
  1 实验材料  37-38
    1.1 实验动物  37
    1.2 试剂与药品  37-38
    1.3 实验仪器  38
  2 实验方法  38-39
    2.1 实验动物  38-39
    2.2 造模方法  39
    2.3 药物制备及给药方法  39
  3 观察方法及测试指标  39-42
    3.1 一般状况观察  39
    3.2 电镜观察  39-40
    3.3 免疫组化观察  40
    3.4 Real time-PCR观察  40-42
    3.5 Western blot观察  42
  4 统计分析方法  42
  5 实验结果  42-55
    5.1 一般状况观察结果  42-45
      5.1.1 治疗前一般状况观察结果  42-43
      5.1.2 治疗后一般状况观察结果  43-45
    5.2 电镜观察结果  45-48
      5.2.1 电镜下结果  45-46
      5.2.2 RPE下沉积物电镜下结果  46-47
      5.2.3 Bruch膜电镜下结果  47-48
    5.3 免疫组化结果  48-50
      5.3.1 Cat B表达的免疫组化结果  48-49
      5.3.2 Cys C表达的免疫组化结果  49-50
    5.4 Real time-PCR检测的Cat B、Cys C mRNA的表达结果  50-53
      5.4.1 原始数据统计图  50-52
      5.4.2 Real time-PCR检测的Cat B mRNA的表达结果  52
      5.4.3 Real time-PCR检测的Cys C mRNA的表达结果  52-53
    5.5 Western blot检测Cat B、Cys C的蛋白表达  53-55
      5.5.1 Western blot检测Cat B、Cys C的蛋白表达结果  53
      5.5.2 Western blot检测Cat B蛋白表达的图像分析结果  53-54
      5.5.3 Western blot检测Cys C蛋白表达的图像分析结果  54-55
      5.5.4 Western blot检测Cat B、Cys C蛋白的表达比值结果  55
  6 讨论  55-64
    6.1 动物模型的评价  55-58
      6.1.1 模型动物的选择及造模方法  55-56
      6.1.2 动物模型的评价  56
      6.1.3 RPE下沉积物、Bruch膜的选择  56-57
      6.1.4 Cat B、Cys C的选择  57
      6.1.5 研究部位的选择  57-58
    6.2 枸杞醇提物的选择及评价  58-59
    6.3 枸杞醇提物对模型小鼠AMD防治作用的研究  59-64
      6.3.1 各组小鼠外观和体重变化的评价  59-60
      6.3.2 枸杞醇提物对RPE下沉积物、Bruch膜作用的评价  60-61
      6.3.3 枸杞醇提物对Cat B作用的评价  61-62
      6.3.4 枸杞醇提物对Cys C作用的评价  62-64
  7 结论  64-65
  参考文献  65-67
第三部分 实验研究二-体外实验  67-80
  1. 实验材料  67
    1.1 实验用细胞  67
    1.2 药物及试剂  67
  2 实验方法  67-68
    2.1 细胞培养  67
    2.2 细胞增殖活性的检测  67-68
    2.3 Western blot检测  68
  3 实验结果  68-73
    3.1 叶黄素和玉米黄质的结构式、分子式和分子量  68-69
    3.2 细胞增殖活性的检测结果  69-71
    3.3 Western blot检测MMP-2、TIMP-2蛋白表达的结果  71-73
  4 讨论  73-77
    4.1 造模方法及模型的评价  73
    4.2 叶黄素和玉米黄质的选择  73-75
    4.3 MMP-2、TIMP-2的选择  75
    4.4 H202溶液对ARPE-19影响的评价  75-76
    4.5 叶黄素和玉米黄质对MMP-2作用的评价  76-77
    4.6 叶黄素和玉米黄质对TIMP-2作用的评价  77
  5 结论  77-78
  参考文献  78-80
全文总结  80-81
年龄相关性黄斑变性的研究治疗进展  81-89
  参考文献  87-89
缩略词表  89-90
攻读博士学位期间取得的研究成果  90-91
致谢  91-92
作者简介  92

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中医皮科 > 现代医学皮肤病、性病
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