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小鼠缺氧致肿瘤样增生速效造模及抗肿瘤候选药物作用机理研究

作 者: 吴佩
导 师: 曾庆平
学 校: 广州中医药大学
专 业: 中医临床基础
关键词: 一氧化氮 缺氧 肿瘤样增生 桦木酸 青蒿琥酯 血府逐瘀片
分类号: R273
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


目的肿瘤的发病原因及发病机制目前还不甚明确,也没有基于病因的动物模型用于抗肿瘤药物筛选,更缺乏以病机为依托的有效预防和治疗手段。为此,我们率先提出“炎症激发一氧化氮(NO)驱动缺氧致瘤”假说,并基于前期关节滑膜炎研究中发现免疫刺激引起NO爆发的结果及滑膜病变初期症状表现及病理特征与肿瘤血管形成和细胞增殖的相似性,利用外源NO释放剂硝普钠(SNP)及内源NO激发剂胶原Ⅱ (CⅡ)、完全弗氏佐剂(CFA)、脂多糖(LPS)诱导小鼠局部组织缺氧,分别建立NO诱导的皮下及滑膜肿瘤样增生模型,初步验证“缺氧致瘤”的可能性,并在此基础上评价几种抗肿瘤候选药物抑制肿瘤样增生的效果。材料与方法将小鼠背部结扎束缚限制供血,并单独或联合注射SNP、CⅡ、CFA建立皮下组织原位肿瘤样增生模型,同时用SNP、CFA或LPS注射小鼠关节腔建立滑膜组织原位肿瘤样增生模型。从形态学、组织化学、免疫组织化学、血液缺氧指标、促炎症细胞因子分泌动态、蛋白质硝基化程度和缺氧响应基因表达谱等方面,对上述非移植肿瘤模型开展病机研究。在小鼠滑膜肿瘤样增生模型上,对两种植物化学成分——桦木酸和青蒿素(可溶性衍生物青蒿琥酯)及一种中成药——血府逐瘀片等抗肿瘤候选药物的用药效果进行评价与比较。结果无论是SNP释放出来的外源NO,还是CⅡ、CFA、LPS激发产生的内源NO,均能促进小鼠皮下组织或滑膜组织局部血管形成和细胞增生,初步证明NO是导致肿瘤样增生的关键因素。在此过程中,血液NO含量升高伴随着皮下或滑膜组织血氧饱和度(SpO2)下降,表明NO是导致局部组织缺氧的直接原因。同时发现,SNP和CⅡ-CFA均能诱导线粒体解偶联蛋白2(UCP2)及若干细胞因子(IL-1α、IL-6、NOTCH1)基因等缺氧响应基因表达,但前者下调NOS2(iNOS)基因,后者上调NOS2基因。还发现内外源NO显著上调血管形成相关的缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)基因和血管内皮生长因子(VEGF)基因表达。本研究将NO与缺氧、血管形成和组织增生等环节有机地联系起来,并成功建立了基于病因及病机的小鼠肿瘤样增生模型。利用小鼠滑膜肿瘤样增生模型,分别对桦木酸、青蒿琥酯和血府逐瘀片等具有抗肿瘤功效的候选药物单体及复方进行了抗增生效果评价及其作用机理研究。结果表明,这些供试药物都表现出显著的抗肿瘤样增生效果,其中桦木酸主要通过抑制HIF-1α转录因子诱导的VEGF表达阻断细胞增生;青蒿琥酯主要通过抑制NO合成阻断细胞增生;血府逐瘀片则通过活血化瘀改善局部组织缺氧阻断细胞增生。对于以上药物的抗肿瘤样增生效果,已分别从肿瘤形态学、组织病理学(组化和免疫组化)和血液缺氧指标(NO和SpO2)等方面进行了评价。结论本研究初步验证了NO介导缺氧促进肿瘤样细胞增生假说,并将肿瘤发生与免疫激活、NO爆发、缺氧诱导、血管形成、细胞增生等关键步骤串联起来,成功建立了小鼠非移植性原位肿瘤样增生模型,并快速评价了几种抗肿瘤候选药物的抗肿瘤样增生效果,基本阐明了它们抗肿瘤样增生的作用机制。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-13
第一章 文献综述  13-23
  1.1 概述  13
  1.2 肿瘤基因外因素的研究进展  13-17
    1.2.1 血管生成与血管内皮细胞生长因子的研究进展  13-14
    1.2.2 缺氧与缺氧诱导因子的相关研究  14-15
    1.2.3 一氧化氮及一氧化氮合酶相关研究  15-17
  1.3 抗肿瘤候选药物的研究进展  17-20
    1.3.1 青蒿琥酯抗肿瘤研究进展  17-19
    1.3.2 桦木酸抗肿瘤机理研究现状  19-20
  1.4 中医药抗肿瘤的研究现状  20-21
  1.5 研究的目的及意义  21-22
  1.6 研究的内容及方法  22-23
第二章 小鼠皮下组织原位增生的诱导与鉴定  23-30
  2.1 实验材料  23-24
    2.1.1 实验试剂与药品  23
    2.1.2 实验仪器  23-24
    2.1.3 实验动物来源及实验环境  24
  2.2 方法  24-25
    2.2.1 皮下组织原位增生造模  24
    2.2.2 SpO2监测  24
    2.2.3 NO测定  24-25
    2.2.4 组化及免疫组化分析  25
    2.2.5 统计学分析  25
  2.3 结果  25-28
    2.3.1 内外源NO对皮下组织增生的影响  25-26
    2.3.2 内外源NO对血管形成基因的诱导  26-27
    2.3.3 组织SpO2及血液NO含量变化  27-28
  2.4 讨论  28-30
第三章 小鼠滑膜增生造模及缺氧响应分析  30-38
  3.1 实验材料  30
    3.1.1 实验试剂与药品  30
    3.1.2 实验仪器  30
    3.1.3 实验动物来源实验环境  30
  3.2 方法  30-31
    3.2.1 滑膜肿瘤样增生的诱导  30
    3.2.2 滑膜肿瘤样增生的阻遏  30
    3.2.3 缺氧响应基因表达谱分析  30
    3.2.4 3-NT及抗CCP抗体测定  30-31
    3.2.5 统计学分析  31
  3.3 结果  31-36
    3.3.1 SNP与CFA诱发的滑膜增生形态及病理比较  31-32
    3.3.2 L-NMMA对CFA诱发滑膜增生缺氧程度的影响  32
    3.3.3 SNP与CⅡ-CFA诱导缺氧基因表达谱分析  32-35
    3.3.4 蛋白质硝基化程度分析  35-36
  3.4 讨论  36-38
第四章 脂多糖介导小鼠滑膜增生及青蒿琥酯的抑制作用  38-42
  4.1 实验材料  38
    4.1.1 实验试剂与药品  38
    4.1.2 实验仪器  38
  4.2 方法  38-39
    4.2.1 LPS造模  38
    4.2.2 青蒿琥酯给药  38
    4.2.3 HIF-1α、VEGF和iNOS表达定量分析  38
    4.2.4 TNF-α测定  38-39
    4.2.5 统计学分析  39
  4.3 结果  39-41
    4.3.1 LPS诱发滑膜增生的形态及病理鉴定  39
    4.3.2 青蒿琥酯的抗缺氧效果  39-40
    4.3.3 青蒿琥酯抗血管增生基因表达  40
    4.3.4 青蒿琥酯的抗炎症作用  40-41
  4.4 讨论  41-42
第五章 桦木酸、青蒿琥酯单用及联用阻断滑膜增生  42-51
  5.1 实验材料  42
    5.1.1 实验试剂与药品  42
    5.1.2 实验仪器  42
  5.2 方法  42-43
    5.2.1 动物造模  42
    5.2.2 缺氧指标及免疫组化测定  42
    5.2.3 TNF-α测定  42-43
    5.2.4 统计学分析  43
  5.3 结果  43-49
    5.3.1 SNP造模后的桦木酸、青蒿琥酯治疗  43-44
    5.3.2 LPS、CFA造模后的桦木酸、青蒿琥酯治疗  44-45
    5.3.3 桦木酸、青蒿琥酯治疗后组化及免疫组化指标比较  45-48
    5.3.4 造模及治疗对TNF-α含量的影响  48-49
  5.4 讨论  49-51
第六章 血府逐瘀片阻断滑膜增生的活血化瘀效应  51-57
  6.1 实验材料  51
    6.1.1 实验试剂与药品  51
    6.1.2 实验仪器  51
    6.1.3 实验动物来源及实验环境  51
  6.2 方法  51-52
    6.2.1 动物造模及给药  51
    6.2.2 NO和SpO2测定  51
    6.2.3 组化及免疫组化分析  51
    6.2.4 TNF-α测定  51-52
    6.2.5 统计学分析  52
  6.3 结果  52-55
    6.3.1 血府逐瘀片治疗的形态学及组织化学比较  52-53
    6.3.2 血府逐瘀片对组织缺氧状况的改善  53-54
    6.3.3 血府逐瘀片的抗缺氧机理  54
    6.3.4 血府逐瘀片的抗炎效果  54-55
  6.4 讨论  55-57
结语  57-58
参考文献  58-67
附录  67-69
致谢  69

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中医肿瘤科
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