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加味桂枝茯苓丸对人卵巢癌细胞CAOV-3增殖的影响及分子机制研究

作　者: 闫珺
导　师: 张广美
学　校: 黑龙江中医药大学
专　业: 中医妇科学
关键词: 桂枝茯苓丸卵巢癌 CAOV-3 增殖信号通路
分类号: R273
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的本实验研究的目的是探讨加味桂枝茯苓丸对人卵巢癌细胞CAOV-3 增殖的影响及分子机制研究,并研究VEGF、AKT、RAF、ERK1/2、IL-6以及CD47等因子是否与该药物治疗的分子机制相关。方法本实验研究分体内和体外两部分研究加味桂枝茯苓丸对卵巢癌CAOV-3细胞的影响。细胞实验：培养人卵巢癌CAOV-3细胞,应用MMT方法检测肿瘤细胞增殖抑制率；应用流式细胞仪检测加味桂枝茯苓丸对卵巢癌CAOV-3细胞凋亡的影响；应用免疫组化法检测CAOV-3细胞中VEGF、AKT、RAF、ERK1/2蛋白的表达；应用Real-time PCR检测VEGF、 AKT、RAF、ERK1/2的mRNA的表达；应用流式细胞术检测其CD47的表达情况。动物实验：将于体外培养的人卵巢癌CAOV-3细胞移植入裸鼠的肩胛部,待成瘤后,给予裸鼠应用加味桂枝茯苓丸治疗,从治疗当日,以后每隔一日观察并测量植入的肿瘤的体积并计算加味桂枝茯苓丸的抑瘤率；应用Real-time PCR检测VEGF、AKT、RAF、ERK1/2的mRNA的表达；应用免疫组化法检测CAOV-3细胞中VEGF、RAF蛋白的表达；应用ELISA检测细胞上清液中IL-6的表达水平。结果细胞实验：(1)应用MTT法检测加味桂枝茯苓丸作用于CAOV-3细胞24h、48h、72h后细胞增殖抑制率,结果显示：随着治疗时间的延长,治疗浓度的增加,肿瘤细胞的存活率明显下降(P<0.01)。根据细胞增殖抑制率计算IC50=0.9mg/ml。根据此项指标,以下细胞实验,采用0,0.3,0.6,0.9,1.2mg/ml的浓度进行细胞实验。治疗24h后提取mRNA及蛋白质。(2)在人卵巢癌CAOV-3细胞中加入加味桂枝茯苓丸药液后,结果显示,随着药物剂量的提高,肿瘤细胞的凋亡率明显上升(P<0.01)。(3)加味桂枝茯苓丸药液治疗后24h,RT-PCR检测VEGF、AKT、RAF、ERK1/2基因mRNA的表达明显下调,且表达水平随治疗剂量的不断增加而逐渐下降(P<0.01)。经药物治疗后24h,随着药物浓度的逐渐增加VEGF. AKT、RAF、ERK1/2蛋白的表达均明显下调(P<0.01)。(4)流式细胞术结果表明,空白组人卵巢癌CAOV-3细胞中CD47表达水平较各治疗组高(P<0.05),两组比较差异显著,有统计学意义。动物实验：(1)加味桂枝茯苓丸对裸鼠皮下肿瘤生长的影响：治疗前各组裸鼠肿瘤大小差异无统计学意义(P>0.05),治疗结束后比较各组PTV,其他组较空白对照组相比相比差异有统计学意义(P<0.05)。组间比较,低剂量组与中剂量组间无统计学差异；与其他两组相比具有统计学意义。中剂量组与高剂量组、阳性对照组相比,差异无统计学意义(2)不同浓度加味桂枝茯苓丸的抑瘤率为25.3%-53.0%。(3)在检测检测VEGF、AKT、RAF、ERK1/2基因表达的实验中发现：各组肿瘤组织提取RNA检测VEGF、AKT、RAF、ERK1/2基因的表达,与空白对照组相比,低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组均发现基因表达下调(P<0.001),组间比较低剂量组和中剂量组与高剂量组和阳性对照组比较均具有统计学差异(P<0.001),高剂量组与阳性对照组比较无统计学差异(P=0.294)。(4)在检测检测VEGF、RAF蛋白表达的实验中发现：空白对照组VEGF、RAF蛋白在细胞浆中表达多,阳性率分别为90%和87.5%；与空白对照组相比,低剂量组,中剂量组,高剂量组,阳性对照组均发现VEGF、RAF表达的阳性率下调(P值分别为P<0.01及P<0.05),组间比较低剂量组和中剂量组与高剂量组和阳性对照组比较均具有统计学差异(P<0.05),高剂量组与阳性对照组比较无统计学差异(P值分别为P=0.302及P=0.405)。(5)分别检测不同分组卵巢癌CAOV-3细胞在治疗3天、7天、11天及14天后细胞上清液中的IL-6浓度逐渐降低,呈明显的时间依赖性；空白对照组无此变化。与空白对照组相比,低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组均发现VEGF表达的阳性率下调(P<0.001),组间比较低剂量组和中剂量组与高剂量组和阳性对照组比较均具有统计学差异(P<0.05),高剂量组与阳性对照组比较无统计学差异(P=0.076)。结论(1)加味桂枝茯苓丸可以抑制卵巢癌肿瘤细胞的生长；(2)加味桂枝茯苓丸可以诱导卵巢癌CAOV-3细胞凋亡；(3)加味桂枝茯苓丸可能通过下调VEGF-AKT信号通路,抑制肿瘤血管生成,从而抑制卵巢癌CAOV-3细胞增殖；(4)加味桂枝茯苓丸可能通过下调MAPK信号通路,抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力,从而抑制卵巢癌CAOV-3细胞增殖；(5)加味桂枝茯苓丸可以降低卵巢癌CAOV-3细胞中IL-6的表达；(6)加味桂枝茯苓丸可以降低卵巢癌CAOV-3细胞中CD47的表达,其可能机制是通过调节吞噬细胞的吞噬作用而起到消灭癌细胞的作用,但为证实此观点仍需后续的实验研究支持。

全文目录

前言  5-6
中文摘要  6-9
Abstract  9-12
中英文对照表  12-13
第一部分文献回顾  13-28
  1 桂枝茯苓丸及其类方的介绍  13-22
    1.1 桂枝茯苓丸介绍  13-14
    1.2 桂枝茯苓丸及其类方的临床应用研究现状  14-20
    1.3 桂枝茯苓丸及其类方的实验研究现状  20-22
  2 医家对卵巢癌的认识  22-28
    2.1 祖国医学对卵巢癌的记载  22-24
    2.2 现代医学对卵巢癌的记载  24-28
第二部分细胞实验  28-48
  1 细胞实验中的共性部分  28-31
    1.1 实验主要器材及化学试剂  28-31
  2 实验一加味桂枝茯苓丸对CAOV-3细胞增殖抑制率的影响  31-34
    2.1 MTT检测方法  31-32
    2.2 结果  32-34
    2.3 小结  34
  3 实验二加味桂枝茯苓丸对人卵巢CAOV-3凋亡率影响  34-36
    3.1 方法  34-35
    3.2 结果  35-36
    3.3 小结  36
  4 实验三加味桂枝茯苓丸对卵巢癌CD47表达水平的影响  36-38
    4.1 方法  37
    4.2 结果  37-38
    4.3 小结  38
  5 实验四加味桂枝茯苓丸对卵巢癌CAOV-3细胞VEGF、AKT、RAF及ERK1/2的影响  38-48
    5.1 方法  41-42
    5.2 结果  42-47
    5.3 小结  47-48
第三部分动物实验  48-69
  1 绪论  48-50
  2 动物实验中的共性部分  50-55
    2.1 材料和方法  50-55
  3 实验一肿瘤体积和抑瘤率的测定  55-57
    3.1 方法  55
    3.2 结果  55-57
    3.3 小结  57
  4 实验二 RT-PCR检测VEGF、AKT、RAF、ERK1/2基因mRNA的表达  57-62
    4.1 方法  57-61
    4.2 结果  61
    4.3 小结  61-62
  5 实验三免疫组化检测VEGF,RAF蛋白的表达  62-66
    5.1 方法  62-63
    5.2 结果  63-65
    5.3 小结  65-66
  6 实验四加味桂枝茯苓丸对卵巢癌CAOV-3细胞IL-6的影响  66-69
    6.1 方法  66
    6.2 IL-6的测量方法  66-67
    6.3 结果  67-68
    6.4 小结  68-69
讨论  69-76
  1 加味桂枝茯苓丸的组成、功效及现代药理研究  69-71
    1.1 加味桂枝茯苓丸的组成及功效  69-70
    1.2 加味桂枝茯苓丸的现代药理研究  70-71
  2 加味桂枝茯苓丸对卵巢癌CAOV-3细胞及相关因子的影响  71-76
    2.1 VEGF、AKT表达与卵巢癌关系  71-72
    2.2 RAF、ERK1/2表达与卵巢癌的关系  72
    2.3 IL-6表达与卵巢癌癌的关系  72-73
    2.4 CD47表达与卵巢癌癌的关系  73
    2.5 加味桂枝茯苓丸抑制卵巢癌细胞增殖的可能机制  73-76
结论  76-77
创新点  77
不足与展望  77-78
参考文献  78-82
攻读博士学位期间发表的论文  82-83
致谢  83-85
个人简历  85

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