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广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查

作　者: 彭志成
导　师: 胡敬东
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟病毒分子流行病学系统进化分析 E2囊膜糖蛋白间接免疫荧光抗体试验
分类号: R181.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

猪瘟是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病，每年给养猪业造成严重经济损失。1833年，猪瘟最早发现于美国的俄亥俄洲，此后，亚洲、非洲、拉丁美洲和欧洲等一些主要养猪的国家，相继报道有猪瘟的爆发和流行。除南极洲外，猪瘟的流行几乎覆盖世界范围内各个国家和地区，对养猪业构成严重威胁。世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类传染病并将其纳入必须申报的疫病目录之中，中国也将其定为Ⅰ类烈性传染病。20世纪90年代末，涂长春研究员及其同事对我国猪瘟进行分子流行病学研究，结果发现在我国流行的基因型有1.1，2.1，2.2和2.3亚型，2.1亚型毒株占主导地位，其中流行于广东省的毒株有2.1b，2.2，2.3和1.1亚型。近几年，陈宁等一些学者研究表明我国东南地区猪瘟流行毒株主要为2.1b毒株。近几十年，大量研究材料显示，猪瘟病毒流行毒株有向Ⅱ群演化的趋势。在亚洲一些国家和地区包括中国、日本、韩国和台湾地区的猪瘟病毒流行毒株，由于猪瘟疫苗的选择压力等因素发生了转变。这种转变可能跟猪瘟病毒自身对宿主选择压力的适应能力有关。而我国广东省近十几年猪瘟病毒流行毒株流行态势尚不清楚。为了充分掌握我国猪瘟高发地区-广东省猪瘟的流行态势以及CSFV流行毒株的遗传多样性，本研究对2011年来自广东省11个城市所辖区、县的不同猪瘟发病猪场或散养户415份猪瘟疑似样本，通过欧盟猪瘟诊断手册推荐使用的巢式RT-PCR方法进行猪瘟病毒核酸检测，共检出猪瘟阳性样本57份，猪瘟阳性率为13.7%。另外，对于猪瘟病毒检测呈阳性的样本，我们又进行了猪蓝耳病病毒（PRRSV），猪圆环病毒2型（PCV-2）和猪伪狂犬病病毒（PRV），三种猪常见病毒病的检测，57份猪瘟阳性样本中，56份检出猪圆环病毒2型（PCV-2），34份检出高致病猪蓝耳病病毒（PRRSV），1份（GDZC-294）检出猪伪狂犬病毒（PRV），广东省猪瘟与猪圆环、猪蓝耳病混合感染十分严重，猪瘟与猪伪狂犬混合感染较轻，与其它疾病混合感染是当今广东猪瘟防控严峻的问题之一。通过对巢式RT-PCR产物进行测序，我们获得57条广东省猪瘟病毒E2主要抗原区域编码基因序列，参考GenBank收录的国内外该段基因序列及实验室以前测得的序列，利用系统进化分析软件MEGA5.05针对该段基因（190bp）对广东省CSFV流行毒株构建系统进化树，遗传进化分析表明在该地区流行的毒株除4株为1.1亚型，其余毒株全部属于2.1亚型，以前该地区流行的2.2和2.3亚型毒株在本研究中没有发现。值得注意地是在进行猪瘟监测的地区出现了2个新的2.1亚亚型，即2.1c和2.1d，这些毒株的流行表明该地区CSFV毒株遗传多样性出现了新的变化。为长期保存这些珍贵的生物学材料，为我国广东省猪瘟的防控积累丰富的病毒资源和探索猪瘟病毒在细胞中的适应特点等研究，我们PK-15和EC两种细胞对57猪瘟病毒阳性样本中猪瘟病毒进行了分离与培养，并初步探索两种细胞对猪瘟病毒的易感性分析。通过病毒分离的方法，我们共分离出24株猪瘟病毒流行毒株，除该地区传统经典流行毒株2.1b外，还涵盖新出现的两个亚型毒株2.1c，2.1d毒株，为今后研究该地区猪瘟病毒提供了物质基础。猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2是病毒识别和吸附宿主细胞的病毒结构蛋白，在CSFV增殖过程中具有重要作用，同时，E2蛋白能够诱导机体产生中和抗体，E2的变异与毒株的免疫逃逸有关。为弄清这两种新出现的亚亚型E2基因遗传变异特点，我们从57份样本中选取具有代表性的16份样本，对这些毒株的E2全基因进行扩增、测序，系统进化分析表明16株CSFV流行毒株有15株为基因2.1亚型，另外1株属于基因1.1亚型，结果和根据E2主要抗原编码基因(190bp)分析结果一致。根据E2全基因核苷酸同源性的大小，我们将2.1亚型猪瘟病毒流行毒株进一步划分为4个亚亚型2.1a，2.1b，2.1c和2.1d。其中，2.1c和2.1d亚亚型毒株是首次报道在该地区流行，到目前为止2.1a毒株尚未发现在广东省流行。通过对猪瘟病毒E2基因核苷酸的系统进化分析和氨基酸序列多序列比对，结果表明2.1亚型中4个亚亚型，具有群特异性的氨基酸替换，这些结果进一步证实了2.1亚型的分型结果的正确性。综上所述，我们通过研究覆盖广东省大部分地区，来自不同猪瘟发病猪场或散养户的疑似病料，开展对我国广东省分子流行病学调查工作，基于E2基因序列的系统进化分析和氨基酸多序列比对证明我国广东省CSFV流行毒株遗传多样性发生变化，有新的2.1c和2.1d亚亚型毒株开始在该地区流行，这些研究结果将为我国广东省猪瘟防控策略的制定提供科学依据。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-14
前言  14-34
  1.1 猪瘟研究进展  14-21
    1.1.1 猪瘟概述  14-15
    1.1.2 猪瘟的一般流行病学  15-18
    1.1.3 猪瘟的分子流行病学  18-19
    1.1.4 猪瘟在全球范围内的流行现状  19-21
  1.2 猪瘟病毒研究进展  21-25
    1.2.1 瘟病毒属病毒  21
    1.2.2 猪瘟病毒分子生物学特性  21-25
  1.3 猪瘟病毒 E2 囊膜糖蛋白  25-29
    1.3.1 猪瘟病毒 E2 基因结构与功能  26-27
    1.3.2 猪瘟病毒 E2 蛋白结构与功能  27-29
  1.4 猪瘟病毒发病机理  29-30
    1.4.1 猪瘟病毒免疫抑制机理  29-30
    1.4.2 猪瘟病毒与宿主细胞  30
  1.5 猪瘟病毒检测技术  30-34
    1.5.1 病毒分离  30-31
    1.5.2 动物试验  31
    1.5.3 血清学检测技术  31-32
    1.5.4 分子生物学诊断技术  32-34
材料与方法  34-52
  2.1 材料  34-37
    2.1.1 疑似 CSF 病料  34
    2.1.2 试剂与耗材  34
    2.1.3 细胞、毒株和抗体  34
    2.1.4 主要的仪器设备与器材  34-35
    2.1.5 实验室常用各种培养基和溶液的配制  35
    2.1.6 引物设计及合成  35-36
    2.1.7 生物信息学分析软件  36-37
  2.2 方法  37-52
    2.2.1 广东省疑似猪瘟样本的检测  37-41
    2.2.2 猪瘟病毒流行毒株的分离与培养  41-44
    2.2.3 基于猪瘟病毒流行毒株 E2 部分基因遗传多样性分析  44-48
    2.2.4 基于猪瘟病毒流行毒株 E2 全长基因遗传多样性分析  48-52
结果  52-71
  3.1 广东省猪瘟病毒检测  52-61
    3.1.1 广东省猪瘟疑似样本检测结果  52
    3.1.2 猪瘟阳性样本混合感染检测结果  52-54
    3.1.3 猪瘟病毒流行毒株分离鉴定  54-57
    3.1.4 PK-15 与 EC 细胞猪瘟病毒易感性比较  57-58
    3.1.5 F2-F5 猪瘟病毒在 PK-15 增殖特点  58-61
  3.2 广东省猪瘟病毒流行毒株遗传多样性分析  61-71
    3.2.1 基于猪瘟病毒流行毒株 E2 部分基因系统进化分析  61-62
    3.2.2 2.1c 亚亚型流行毒株分支年代的估算  62-64
    3.2.3 基于猪瘟病毒流行毒株 E2 全长基因系统进化分析  64
    3.2.4 猪瘟病毒流行毒株 E2 蛋白氨基酸序列分析  64-71
讨论  71-79
  4.1 广东省猪瘟疑似样本检测  71-73
    4.1.1 猪瘟其它三种猪常见病毒病混合感染严重  71
    4.1.2 猪瘟病毒细胞分离与培养  71-73
  4.2 广东省猪瘟病毒流行毒株遗传多样性  73-79
    4.2.1 基于猪瘟病毒流行毒株 E2 部分基因系统进化分析  73-75
    4.2.2 2.1c 亚亚型流行毒株进化分支年代估算  75-76
    4.2.3 基于猪瘟病毒流行毒株 E2 全长基因遗传多样性分析  76-79
结论  79-80
参考文献  80-91
致谢  91-92
攻读硕士学位期间发表的论文  92-93
附录  93-112

广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查

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