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食品添加剂中的金属纳米氧化物与维生素C对于胃肠道系统和神经系统的复合毒性效应研究

作　者: 隋科科
导　师: 刘元方
学　校: 上海大学
专　业: 环境工程
关键词: 金属纳米氧化物维生素C 联合毒性胃肠道系统神经系统
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着纳米技术的飞速发展，金属纳米氧化物已经在食品添加剂领域得到了广泛的应用，并引起了科学界的关注。锌、硅、铜、钛等的金属纳米氧化物在食品安全技术领域在一定用量范围内是允许被使用的。食品和药品管理局（FDA）已经将氧化锌（ZnO）列为食品添加剂中普遍公认的安全材料。自从1990年以来，二氧化钛（TiO2）作为白色颜料广泛应用于食品添加剂领域，例如，奶酪、糖果、白巧克力。目前，食品添加剂安全评估标准往往是基于单独添加剂的毒性效应建立起来的，而人们每天摄入的食物种类繁多，一种食品中往往存在多种食品添加剂联合使用的情况。因此，正确评价食品添加剂的联合毒性作用，对食品添加剂的安全使用具有重要意义。维生素C（VC）是生物液体合成和免疫系统功能中强有力的水溶性抗氧化剂，许多食品中都添加VC以提高人体免疫力。探究食品添加剂中金属纳米氧化物与VC对于胃肠道系统和神经系统的联合毒性是非常有必要的。由此，本研究使用人胃黏膜上皮细胞（GES-1）和神经干细胞（C17.2）分别作为胃肠道系统和神经系统的模型，采用检测细胞成活率、细胞凋亡和死亡、细胞内钙离子浓度的变化以及观察细胞形态等方法探究复杂体系的联合毒性。并研究了不同种类、不同作用浓度、不同粒径、不同性质（亲水或亲油）的金属纳米氧化物的细胞毒理学影响。首先，本论文利用透射电子显微镜、X射线荧光分析、X射线衍射技术、NTA、Zeta电位、红外光谱等方法对所选样品的粒径、晶体结构、纯度、培养基和水中样品的粒径及表面电势、样品表面性质等进行了表征。本研究应用了六种氧化锌纳米颗粒（ZnO-NPs），分别命名为ZnO-1（纳米颗粒平均直径为20纳米，亲水性）、ZnO-2（纳米颗粒平均直径为20纳米，亲油性）、ZnO-3（纳米颗粒平均直径为100纳米，亲水性）、ZnO-4（纳米颗粒平均直径为100纳米，亲油性）、ZnO-5（纳米颗粒平均直径为100纳米，食品级）和ZnO-6（纳米颗粒的平均粒径为100纳米，食品级），且ZnO-5、ZnO-6来自不同的制造商。应用了四种二氧化钛纳米颗粒（TiO2-NPs），分别命名为TiO2-1（纳米颗粒平均直径20纳米，亲水性）， TiO2-2（纳米颗粒平均直径20纳米，亲油性），TiO2-3（纳米颗粒平均直径50纳米，高分散食品级）和TiO2-4（纳米颗粒的平均粒径为50纳米，食品级）。TEM照片显示了ZnO-NPs和TiO2-NPs的形貌和粒径是不同的，而NTA实验结果显示，相同样品在水中或培养基中的粒径是相似的。据X射线荧光（光谱仪）分析结果，所有纳米材料的纯度均高于95%。基于X射线衍射（XRD）检测，六种氧化锌皆六方晶型，二氧化钛为锐钛矿型。在此基础上，本文研究了金属纳米氧化物与VC复合体系对细胞的联合毒性作用。研究表明，单独ZnO-NPs作用浓度小于15μg/mL时，对两种细胞均没有显著的毒性效应，且单独VC作用浓度小于300μg/mL时对细胞也是安全的。当ZnO-NPs的浓度为15μg/mL时，GES-1细胞和C17.2细胞的存活率均高于90%，当VC浓度为300μg/mL时，GES-1细胞和C17.2细胞的存活率均高于95%，然而，当15μg/mL的ZnO-NPs与300μg/mL的VC共同作用时，VC能够加强氧化锌对于细胞（GES-1和C17.2）的毒性，细胞的成活率在30%左右。通过凋亡对比实验可以发现，细胞染毒24h后，单独的VC （300μg/mL）和单独的ZnO-5（15μg/mL）均没有引起细胞（GES-1和C17.2）早期凋亡而产生明显变化，但是ZnO-5（15μg/mL）&VC （300μg/mL）组的凋亡率与对照组相比显著上升，对GES-1细胞的凋亡率高达52.17%，死亡率达5.46%；对C17.2细胞的凋亡率高达51.38%，死亡率达9.44%。使用Fluo-3探针检测暴露于单独的ZnO-5（15μg/mL），单独的VC （300μg/mL）以及ZnO-5（15μg/mL）&VC （300μg/mL）2h后的三组GES-1和C17.2细胞，与对照组相比，单独的ZnO-5（15μg/mL）和VC（300μg/mL）均没有引起细胞内钙离子的明显变化，但是ZnO-5（15μg/mL）&VC（300μg/mL）组细胞内钙离子浓度显著上升。通过激光扫描共聚焦显微镜Confocal拍摄处理后的GES-1和C17.2细胞，结果显示与空白组对比，单独的ZnO-5（15μg/mL）和单独的VC （300μg/mL）均没有引起细胞核的显著性变形或死亡，但是ZnO-NPs（15μg/mL）&VC （300μg/mL）组的细胞核却显著变形，说明大部分细胞已经死亡。但同样作为金属纳米氧化物的二氧化钛与VC共同作用时，VC对细胞没有表现出联合毒性效应。最后，本文探究了两种金属纳米氧化物产生不同结论的原因。研究发现，由于ZnO-NPs极易与VC发生反应，使得30μg/mL的氧化锌溶液中Zn²⁺的溶解度由17μg/mL增加到29μg/mL，由于氧化锌对细胞的毒性主要是由Zn²⁺引起的，该变化使其对细胞的影响加剧。另一方面，VC与ZnO-NPs反应致使ZnO-NPs的团聚减小，从而更容易进入细胞，对细胞造成一定程度的损伤。本文为今后复合体系中金属纳米材料毒性和食品安全方面的研究提供了研究方法和重要数据基础，对复杂体系领域的研究具有重要意义。

全文目录

摘要  6-9
ABSTRACT  9-12
目录  12-15
第一章绪论  15-29
  1.1 引言  15-16
  1.2 金属纳米氧化物（ZNO 和 TIO2）简介  16-19
    1.2.1 纳米氧化锌的性质及应用  16-17
    1.2.2 纳米二氧化钛的性质及应用  17-19
  1.3 金属纳米氧化物的生物安全性研究  19-28
    1.3.1 纳米材料与生物体相互作用机理研究  19-20
    1.3.2 纳米氧化锌的生物安全性研究  20-24
    1.3.3 纳米二氧化钛的生物安全性研究  24-26
    1.3.4 纳米材料在复杂体系中的毒性研究现状  26-28
  1.4 论文研究的目的、意义及内容  28-29
第二章金属纳米氧化物的表征  29-40
  2.1 引言  29-30
  2.2 实验部分  30-31
    2.2.1 实验试剂  30
    2.2.2 实验设备  30
    2.2.3 样品介绍  30-31
  2.3 样品的表征  31-33
    2.3.1 样品表面形貌的观测  31
    2.3.2 样品晶型的测定  31-32
    2.3.3 样品纯度的测定  32
    2.3.4 溶液中的粒径分析  32-33
    2.3.5 表面电势分析  33
    2.3.6 样品成分的测定  33
  2.4 结果与讨论  33-39
    2.4.1 样品形貌表征  33-35
    2.4.2 样品晶型的表征  35-36
    2.4.3 样品纯度的测定  36-37
    2.4.4 样品在水中和培养基中的粒径  37
    2.4.5 样品在水中和培养基中的表面电势  37-38
    2.4.6 样品的红外光谱表征  38-39
  2.5 本章小结  39-40
第三章食品添加剂中氧化锌与维生素 C 对胃肠道系统和神经系统的毒性作用  40-57
  3.1 引言  40
  3.2 实验部分  40-47
    3.2.1 实验材料  40-41
    3.2.2 实验设备  41-42
    3.2.3 GES-1 细胞的体外培养  42
    3.2.4 C17.2 细胞的体外培养  42-43
    3.2.5 细胞的冻存和复苏  43
    3.2.6 CCK-8 法测细胞活力  43-44
    3.2.7 AnnexinV/PI 双染检测细胞凋亡  44-45
    3.2.8 细胞内钙离子浓度检测  45-46
    3.2.9 DAPI 染色检测细胞核完整性  46-47
    3.2.10 统计学分析  47
  3.3 结果与讨论  47-56
  3.4 本章小结  56-57
第四章食品添加剂中二氧化钛与维生素 C 对胃肠道系统和神经系统的毒性作用  57-67
  4.1 引言  57
  4.2 实验部分  57-62
    4.2.1 实验材料  57-58
    4.2.2 实验设备  58-59
    4.2.3 GES-1 细胞的体外培养  59
    4.2.4 C17.2 细胞的体外培养  59
    4.2.5 细胞的冻存和复苏  59-60
    4.2.6 CCK-8 法测细胞活力  60-61
    4.2.7 AnnexinV/PI 双染检测细胞凋亡  61-62
    4.2.8 统计学分析  62
  4.3 结果和讨论  62-66
  4.4 本章小结  66-67
第五章纳米氧化锌与维生素 C 复合效应的机理探讨  67-76
  5.1 引言  67
  5.2 实验部分  67-71
    5.2.1 实验试剂  67-68
    5.2.2 实验设备  68-69
    5.2.3 ICP 测定 ZnO 的溶解度  69
    5.2.4 CCK-8 法测细胞活力  69-70
    5.2.5 LDH（乳酸脱氢酶）法测细胞膜完整性  70-71
  5.3 结果和讨论  71-75
  5.4 本章小结  75-76
第六章结论与展望  76-78
参考文献  78-86
作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文、专利以及参与的科研项目  86-87
致谢  87

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