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过氧化苯甲酰对HepG2细胞DNA损伤作用及其可能的毒性机制研究
作 者: 于媛媛
导 师: 陈敏
学 校: 大连医科大学
专 业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: BPO DNA损伤 氧化应激 溶酶体膜稳定性 线粒体膜电位
分类号: R114
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
目的:过氧化苯甲酰(benzoyl peroxide,BPO)是我国自上世纪80年代以来普遍添加于面粉中的一种漂白剂,它具有增白面粉、加速面粉后熟、抑制面粉霉变、提高出粉率等作用。近年来,人们愈发关注它作为食品添加剂产生的安全隐患问题,使其应用备受争议。我国于2011年5月起禁止使用过氧化苯甲酰作为食品添加剂。而在世界范围内,仍有多个国家继续使用过氧化苯甲酰作为食品添加剂,且添加量参差。目前有研究表明外用BPO作为治疗痤疮的药物成分存在致癌可能,但摄入BPO具体对人类健康存在哪些影响及危害,仍无定论。因有报道BPO加热时可分解产生苯自由基,受此启发,拟探讨BPO产生的活性氧对HepG2细胞是否具有遗传毒性,并进一步研究其机制。我们选用的HepG2细胞是来源于人类的肝癌细胞系,它保留了人类正常肝实质细胞的许多功能,有较完整的生物转化代谢酶活性,被认为是检测外来化合物遗传毒性的理想细胞系。本实验研究选用HepG2细胞,检测BPO的遗传毒性及其氧化应激及溶酶体、线粒体途径的毒理学机制,旨在为摄入BPO引发的人类健康安全隐患提供试验及理论依据。方法:以HepG2细胞作为检测系统。用单细胞凝胶电泳(SGCE)来检测DNA链的断裂,用蛋白质印迹法(western blot)来检测损伤蛋白P53的生成。为了阐明BPO对HepG2细胞的遗传毒性机制,用2’,7’—二氢二氯荧光素(DCFH)来测定细胞内活性氧(ROS)水平,通过N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预试验减少ROS生成来探讨氧化性损伤氧化应激在对DNA损伤中发挥的作用;分别以吖啶橙(AO)和罗丹明123(Rhodamine123)为探针来测定细胞内溶酶体膜稳定性和线粒体膜电位的改变水平,通过氯化铵(NH4Cl,溶酶体膜保护剂)、地昔帕明(desipramine,酸性神经鞘磷脂酶的抑制剂)进行干预来探讨溶酶体膜稳定性与DNA损伤的关系。此外,分别用NAC、NH4Cl和地西帕明干预单细胞凝胶电泳实验与蛋白质印迹实验,以更好的验证试验机制。试验结果用SPSS v11.5统计软件进行统计分析。结果:25-100μMBPO与HepG2细胞接触1h后,细胞内DNA链发生断裂,荧光显微镜下观察到细胞呈彗星样拖尾,其尾长和尾DNA含量随药物浓度增加而明显增加,呈剂量依赖效应,用NAC、NH4Cl、地西帕明进行干预后,尾长和尾DNA含量明显减少。25-100μMBPO与HepG2细胞接触24h后,检测到P53表达明显增多,呈剂量依赖效应,用NAC、氯化铵、地西帕明干预后,P53表达明显减少。25-100μMBPO作用于HepG2细胞1h后,引起细胞内ROS水平的增高,与对照组相比其差异具有统计学意义,用NAC干预后,ROS水平明显下降。25-100μMBPO与HepG2细胞接触1h后,溶酶体膜稳定性下降,呈剂量依赖效应,用NAC、氯化铵干预后,溶酶体膜稳定性得到一定保护。25-100μMBPO与HepG2细胞反应一小时,可使HepG2细胞线粒体膜电位下降,其差别具有统计学意义。结论:BPO(25-100μM)可以导致HepG2细胞DNA损伤,对HepG2细胞具有遗传毒性。同时,研究还表明BPO(25-100μM)可以导致HepG2细胞内ROS水平增高,且用抗氧化剂NAC干预后ROS水平明显降低,同时DNA链断裂程度减弱,损伤蛋白P53表达减少,表明该DNA损伤可能与氧化应激有关。BPO(25-100μM)可导致HepG2细胞内溶酶体膜稳定性降低,氯化铵与地西帕明的干预使HepG2细胞溶酶体膜稳定性升高,且能减弱DNA链断裂的程度,减少P53的表达,表明BPO所致HepG2细胞遗传毒性也与溶酶体途径有关。BPO(25-100μM)同样可使HepG2细胞线粒体膜电位下降,一定程度上表明线粒体途径也是该遗传毒性的可能机制之一。
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全文目录
摘要 7-9 Abstract 9-11 前言 11-12 材料和方法 12-16 1. 材料 12-13 1.1 主要药品与试剂 12 1.2 主要仪器 12-13 2. 试验方法 13-16 2.1 细胞培养 13 2.2 单细胞凝胶电泳(SCGE)试验 13-14 2.3 蛋白质印迹法试验 14-15 2.4 细胞内活性氧类(ROS)测定 15 2.5 细胞内溶酶体膜稳定性的测定 15 2.6 细胞内线粒体膜电位的测定 15-16 2.7 统计方法 16 结果 16-24 1. BPO 诱发 HepG2 细胞 DNA 链断裂 16-17 2. BPO 对 HepG2 细胞 P53 表达水平的影响 17-18 3. BPO 对 HepG2 细胞 ROS 水平的影响 18 4. BPO 对 HepG2 细胞溶酶体膜稳定性的影响 18-19 5. BPO 对 HepG2 细胞线粒体膜电位的影响 19 6. NAC 对.BPO 引起的 HepG2 细胞 DNA 损伤的保护作用 19-20 7. NH4Cl 对.BPO 引起的 HepG2 细胞 DNA 损伤的保护作用 20-21 8. 地西帕明对.BPO 引起的 HepG2 细胞 DNA 损伤的保护作用 21-22 9. NAC、NH4Cl、地西帕明对 BPO 所致 P53 表达的保护作用 22-24 讨论 24-28 结论 28-29 参考文献 29-32 综述 32-38 参考文献 36-38 致谢 38-39
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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 卫生基础科学 > 卫生毒理
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