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铅神经毒性相关microRNA表达谱改变及其作用的初步研究

作　者: 安俊
导　师: 陈景元
学　校: 第四军医大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: miRNA 铅神经毒性 PC12细胞
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

【背景】铅是危害人体健康的一种常见环境重金属毒物，分布广泛，主要靶器官是中枢神经系统，严重影响儿童的生长发育和智力水平，还会造成大脑损伤、精神发育迟滞、发育缓慢、行为异常和暴力倾向等，重度铅暴露甚至可以引起死亡[1-3]。铅中毒的发生、发展非常隐匿，常为低剂量长期慢性暴露所致，目前尚无特别有效的治疗方法。铅在人体代谢缓慢，半衰期长，慢性蓄积毒性效应可一直延续到成年甚至老年，引起神经退行性疾病。因此，揭示铅的神经毒性机制尤其是对学习记忆影响的分子生物学机制，提出切实有效的诊疗、防治措施刻不容缓。miRNA通过在转录后水平负性调节靶mRNA的表达。miRNA在大脑中的表达丰度很高，在神经发育、突触可塑性以及学习记忆方面起重要作用。miRNA具有在树突周围瞬时、区域表达的特点，对外界刺激具有活动依赖的反应模式，且一个miRNA可以同时调节多个靶mRNA，一个mRNA也可以同时接受多个miRNA的调节，使得大脑特异性miRNA成为神经可塑性和记忆形成微调基因表达的可靠候选。因此我们预测miRNA在铅诱导的神经毒性和学习记忆损伤中可能发挥了重要的作用。【目的】在建立铅暴露诱导大鼠学习记忆能力和海马神经元损伤模型的基础上，探讨miRNA表达谱的变化；验证miRNA是否参与了铅诱导的神经毒性效应；揭示miRNA在铅诱导的神经毒性中的作用和机制；为铅中毒的预防和治疗提供实验依据。【方法】1、通过饮水染铅、血铅监测的方法建立铅暴露动物模型；通过体外培养PC12细胞系染铅的方法建立细胞模型。2、通过水迷宫实验（Morris Water Maze）监测隐蔽平台潜伏期、去平台目标象限停留时间等指标评价大鼠空间学习记忆能力；运用TUNEL、Western blot和免疫组织化学染色方法检测铅暴露大鼠海马组织损伤状况。3、运用miRNA芯片（microarry analysis）检测miRNA表达谱的改变并通过qRT-PCR技术加以验证。4、运用生物信息学方法预测miRNA靶基因并用Western blot方法验证预测结果。5、运用miRNA抑制剂（miRNA inhibitor）建立“Loss of function”模型，初步探究miRNA参与铅诱导的神经毒性的作用机制。【结果】1、铅可以引起SD大鼠空间学习记忆能力降低铅暴露组（包括100ppm、200ppm和300ppm组）大鼠在8周饮水染铅暴露过程中和对照组大鼠相比，饮水量和体重变化均无统计学差异，而血铅水平随暴露时间延长及暴露剂量增加显著升高。Morris水迷宫实验结果显示染铅大鼠空间学习记忆能力明显受损，Western blot结果显示海马组织学习记忆相关的谷氨酸受体、NMDA受体等表达水平降低。2、铅可以诱导神经元凋亡300ppm饮水铅暴露8w大鼠模型和10μmol/L铅暴露48h PC12细胞模型TUNEL检测均显示铅可以分别诱导海马神经元和PC12细胞凋亡增加，提示铅可能是通过诱导神经元凋亡引起学习记忆能力改变。3、铅诱导海马组织miRNA表达谱发生改变miRNA芯片结果显示断乳SD大鼠饮水染铅300ppm8w后海马组织与对照组相比，7个miRNA表达水平发生显著变化，其中miR-204、miR-211、miR-448、miR-449a、miR-34c、miR-34b表达水平升高1.5倍以上；miR-494表达降低为原来的1/6。qRT-PCR验证结果与芯片结果一致。筛选其中表达差异较大的三种miRNA（miR-204、miR-211和miR-448），分别对2w、4w、6w和8w的海马组织进行qRT-PCR验证，结果表明三种miRNA表达水平均升高。4、生物信息学技术分析结果显示差异表达显著的miRNA靶基因与凋亡、LTP/LTD、钙信号通路等相关，且三个miRNA具有共同的靶基因即Bcl-2和Itpr1应用生物信息学技术（DIANA、TargetScan和miRNA三个网站）分析预测miRNA的靶基因与凋亡、轴突延伸、钙信号通路、LTP/LTD、MAPK信号通路、Notch信号通路、紧密连接和神经退行性疾病相关。其中miR-204、miR-211和miR-448拥有共同靶基因，即与凋亡相关的Bcl-2和与钙通道相关的Itpr1，Western blot和qRT-PCR方法验证的结果（动物和PC12细胞）与预测结果一致。5、干扰miR-204、miR-211和miR-448表达，能在一定程度上保护细胞免受铅暴露损伤的影响应用miRNAinhibitor建立“Loss of function”模型，使用MTT、TUNEL等方法验证干扰miRNA后铅对PC12细胞活力和凋亡的影响，结果发现干扰miRNA表达后能在一定程度上保护PC12细胞免受铅暴露损伤的影响，其中干涉miR-448表达后可使细胞活力提高约20%。【结论】1、铅暴露可能通过引起海马神经元凋亡影响学习记忆功能。2、铅暴露可以引起海马miRNA表达谱发生改变，这种改变可能在铅神经毒性作用中发挥着重要作用。3、差异表达显著的miR-204、miR-211和miR-448可以通过负性调节其共同靶基因与凋亡相关的Bcl-2和与钙离子通道相关的Itpr1影响铅的神经毒性作用。4、干扰miR-204、miR-211和miR-448表达，能在一定程度上保护细胞免受铅暴露的损伤。

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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 卫生基础科学 > 卫生毒理
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