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牡蛎包纳米虫体外培养及多克隆抗体制备研究
作 者: 王飞
导 师: 杨莲茹
学 校: 内蒙古农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 牡蛎包纳米虫 体外培养 纯化 荧光原位杂交 多克隆抗体
分类号: S944
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
近年来,牡蛎包纳米虫病在欧洲等地频发,引起牡蛎大范围的死亡,对牡蛎养殖业危害极大。目前关于包纳米虫的研究处于初级阶段,病原体外培养技术的缺乏是阻碍深入研究包纳米虫的致病机理、虫体与宿主的相互作用及疫病防控的重要瓶颈。本研究主要包括三部分内容:1、取经PCR初步鉴定的包纳米虫病阳性牡蛎全组织直接培养,体外培养一个月后,采用原位杂交、荧光原位杂交方法对培养的包纳米虫进行鉴定。结果表明:此培养方法能在体外成功传递培养三代牡蛎包纳米虫,并最终获取了大量虫体。2、采用密度梯度离心法对培养的牡蛎包纳米虫进行纯化,并利用荧光定量PCR方法对Percoll纯化的六层沉淀中所含虫体进行定量测定。结果表明:各界面的包纳米虫含量不等,其数量在9.63%(60%-70%界面)到29.08%(30%界面)之间,各层中存活的牡蛎包纳米虫至少为22.7%。3、以纯化的牡蛎包纳米虫为抗原免疫小鼠,获得了牡蛎包纳米虫多克隆抗体。利用Western blot技术,证明此多克隆抗体确为牡蛎包纳米虫的特异性抗体。综上所述,本研究首次成功建立了一种简单可行的牡蛎包纳米虫体外培养方法,并以纯化的包纳米虫免疫小鼠的方法获得了牡蛎包纳米虫特异性多克隆抗体,为牡蛎包纳米虫病的免疫学检测技术研究奠定了基础。
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全文目录
摘要 3-4 Abstract 4-9 引言 9-18 1 包纳米虫综述 9-13 1.1 包纳米虫生物学特性 9-10 1.2 常见牡蛎包纳米虫病的检测方法 10-13 2 原生寄生虫的培养综述 13-16 2.1 间日疟原虫的培养 13-14 2.2 伯氏疟原虫的培养 14-15 2.3 贝类派琴虫的培养 15-16 3 本研究的目的与意义 16-18 研究一 牡蛎包纳米虫的培养及鉴定 18-35 1 材料与方法 18-26 1.1 材料 18-20 1.1.1 样品来源 18 1.1.2 试剂与药品 18 1.1.3 仪器与耗材 18-19 1.1.4 试验所用溶液的配制方法 19-20 1.2 方法 20-26 1.2.1 牡蛎包纳米虫的DNA提取 20-22 1.2.2 牡蛎包纳米虫的体外培养 22-23 1.2.3 牡蛎包纳米虫的鉴定 23-26 2 结果 26-33 2.1 DNA提取 26-27 2.1.1 DNA提取方法的比较 26-27 2.1.2 样品前处理对样品DNA提取效率的影响 27 2.2 牡蛎样品PCR检测结果 27-28 2.3 牡蛎包纳米虫培养 28-30 2.3.1 牡蛎包纳米虫培养条件选择结果 28-30 2.3.2 牡蛎包纳米虫的原代培养结果 30 2.4 牡蛎包纳米虫培养结果 30-33 2.4.1 原位杂交鉴定结果 30-32 2.4.2 荧光原位杂交鉴定结果 32-33 3 讨论 33-35 研究二 牡蛎包纳米虫的纯化 35-41 1 材料与方法 35-37 1.1 材料 35-36 1.1.1 样品来源 35 1.1.2 试剂与药品 35 1.1.3 仪器与耗材 35 1.1.4 试验所用溶液的配制方法 35-36 1.2 方法 36-37 1.2.1 牡蛎包纳米虫蔗糖纯化 36 1.2.2 牡蛎包纳米虫Percoll纯化 36 1.2.3 牡蛎包纳米虫纯化PCR鉴定 36-37 1.2.4 牡蛎包纳米虫Percoll纯化RTFQ-PCR定量测定 37 2 结果 37-39 2.1 牡蛎包纳米虫蔗糖纯化PCR鉴定结果 37 2.2 牡蛎包纳米虫Percoll纯化PCR鉴定结果 37-38 2.3 牡蛎包纳米虫Percoll纯化的RTFQ-PCR定量测定结果 38-39 3 讨论 39-41 研究三 牡蛎包纳米虫特异性多克隆抗体的获取与鉴定 41-47 1 材料与方法 41-44 1.1 材料与仪器 41-42 1.1.1 材料 41 1.1.2 主要试剂与仪器 41 1.1.3 主要试剂的配制 41-42 1.2 方法 42-44 1.2.1 抗原的动物免疫 42 1.2.2 抗体效价检测-间接酶联免疫吸附法(ELISA) 42-43 1.2.3 多克隆抗体的Western blot检测样品制备 43 1.2.4 Western blot检测 43-44 2 结果 44-45 2.1 免疫动物血清效价检测结果 44 2.2 多克隆抗体Western blot鉴定结果 44-45 3 讨论 45-47 结论 47-48 致谢 48-49 参考文献 49-54 作者简介 54
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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 贝类病害、敌害及其防治
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