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斑点叉尾鮰肾脏细胞系建立与出血病病原学研究

作　者: 徐进
导　师: 龚世园
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 斑点叉尾鲴(Ictalurus puncatatus) 斑点叉尾鲴肾脏细胞系 出血病 病原学 呼肠孤病毒 基因组 灭活疫苗 β丙内酯
分类号: S943
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


斑点叉尾鮰自1984年引进我国养殖以来,成为我国主要出口创汇的名优养殖鱼类,已在我国20多个省市推广养殖,每年产量达22万吨以上。随着产量的增长,集约化程度的提高以及种质的退化,使得病害问题也越来越严重。近年来全国各地爆发疑似病毒性的出血性疾病,给斑点叉尾鮰养殖造成了巨大的经济损失。为了能分离病毒性病原,本研究从斑点叉尾鮰组织细胞系入手,建立了斑点叉尾鮰肾脏细胞系,并应用该细胞系针对斑点叉尾鮰出血病开展了病原学和疫苗研究,研究结果如下：1.斑点叉尾鮰肾脏细胞系的建立：采用组织块移植培养技术,对来源于斑点叉尾鮰肾脏组织的细胞进行原代培养,建立了斑点叉尾鮰肾脏组织细胞系,已稳定传代培养70多次,定名为CCK。斑点叉尾鮰肾脏组织细胞为成纤维样细胞,最佳培养基为M199,最适培养温度范围为28-32℃,培养基血清浓度为10%,此条件下CCK细胞的倍增时间约为38.9-41.0h。斑点叉尾鲴肾脏细胞的集落形成效率为74.16±3.54%,第9代传代细胞的染色体数目为正常二倍体2n=58,第33代传代细胞的染色体众数为2n=60。液氮冷冻保存6个月后的细胞经台盼兰染色检验,86.69±1.04%仍保持活性,细胞复苏后培养生长旺盛。通过对离体培养细胞的核糖体28S基因进行PCR扩增及序列分析与比对,表明该细胞系来源于斑点叉尾鲴。2.斑点叉尾鲴出血病的病原学研究：从湖北省一爆发出血病的斑点叉尾鲴鱼种养殖场分离到一株呼肠孤病毒,命名为CCRV-730.人工感染试验证实该病毒即为斑点叉尾鲴出血病的病原。斑点叉尾鲴出血病的主要症状包括腹部膨大,眼睛凸出,鳃盖、下颌、皮肤以及鳍条基部出血。用CCK细胞进行了病毒培养与分离,电子显微镜下可见大量呼肠孤病毒样颗粒以晶格状排列于细胞质中,直径60-70nm,提取病毒基因组总RNA,并用SDS-PAGE电泳分析其电泳型,克隆并测序了基因组S组节段基因的完整序列。将S组节段基因序列在NCBI基因库中进行比对分析,发现CCRV-730和水生呼肠孤病毒属的成员相似性最高,特别是和草鱼呼肠孤病毒873株(GCRV-873)相应片段的相似性高达99%～100%。这些结果表明GCRV-873可能在自然界发生基因变异,这些变异改变了其宿主专一性,扩大了宿主范围,使其成为斑点叉尾鮰的病原。3.斑点叉尾鮰出血病细胞培养灭活疫苗研究：以β丙内酯作为灭活剂,制备了斑点叉尾鮰细胞培养灭活疫苗,对疫苗的安全性、免疫效果进行了评估。结果显示,以终浓度为0.025%(V/V)的β内酯于4℃灭活CCRV-730病毒液24h,即可达到理想的灭活效果,灭活疫苗的细胞感染试验与鱼体感染试验均证实病毒已被灭活,无菌检验显示疫苗无细菌污染,表明此法制备的疫苗安全性好。免疫保护效果试验结果显示,在实验室条件下,规格为8～10cm的斑点叉尾鮰鱼种每尾腹腔注射0.2mL效价为105TCID50/mL的疫苗,可获得高达89.1%的保护力。池塘养殖试验免疫保护效果结果显示,采用浸泡的方式免疫4～6cm小规格鱼种也可获得72.6%的保护力。上述结果表明,无论是通过注射免疫还是浸泡免疫,β丙内酯灭活疫苗免疫的斑点叉尾鮰鱼种能获得很好的保护力,此疫苗可在生产上进行广泛应用以预防斑点叉尾鮰出血病。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-14
缩略语表  14-16
第一章 文献综述与研究目的及意义  16-43
  1 淡水鱼类细胞培养及其应用  16-21
    1.1 鱼类细胞的培养  16-18
      1.1.1 培养方法  16-17
      1.1.2 鱼类细胞培养现状  17-18
    1.2 鱼类细胞系的主要应用  18-20
      1.2.1 鱼类病毒学的研究  18-19
      1.2.2 鱼类毒理学的研究  19
      1.2.3 鱼类细胞疫苗的制备  19-20
      1.2.4 鱼类免疫学的研究  20
      1.2.5 鱼类肿瘤研究  20
    1.3 小结  20-21
  2 斑点叉尾鮰病毒病研究进展  21-27
    2.1 CCVD的症状与流行病学  21-23
    2.2 CCV的分子生物学特征  23-24
    2.3 CCV的分离与检测方法  24-27
      2.3.1 电镜技术  24
      2.3.2 细胞培养技术  24-25
      2.3.3 免疫学检测技术  25-26
      2.3.4 分子生物学技术  26-27
  3 水生呼肠孤病毒研究进展  27-34
    3.1 前言  27
    3.2 分类学  27-29
    3.3 化特性  29-30
    3.4 形态结构  30-31
    3.5 水生动物呼肠孤病毒基因组及其编码的蛋白  31-32
    3.6 基因组转录与翻译  32
    3.7 病毒复制与细胞培养特性  32-33
    3.8 致病机制以及引起的组织病理学变化  33
    3.9 小结  33-34
  4 水产疫苗研究进展  34-36
    4.1 前言  34
    4.2 疫苗发展历程  34-36
      4.2.1 灭活疫苗  35
      4.2.2 减毒疫苗  35-36
      4.2.3 核酸疫苗  36
      4.2.4 单位和基因工程疫苗  36
  5 斑点叉尾鮰疫苗研究进展  36-42
    5.1 灭活疫苗与亚单位疫苗  38-39
      5.1.1 灭活疫苗  38
      5.1.2 单位疫苗  38-39
    5.2 减毒活疫苗  39-40
    5.3 DNA疫苗  40-42
  6 选题的目的与意义  42-43
第二章 斑点叉尾鮰肾脏组织细胞系的建立及其生物学特性  43-57
  1 前言  43-44
  2 材料与方法  44-48
    2.1 材料  44-45
      2.1.1 实验鱼  44
      2.1.2 试剂  44
      2.1.3 耗料与器皿  44-45
      2.1.4 仪器设备  45
    2.2 实验方法  45-48
      2.2.1 原代培养  45
      2.2.2 传代培养  45-46
      2.2.3 细胞最佳培养条件  46
      2.2.4 细胞冻存与复苏后  46-47
      2.2.5 细胞集落形成效率  47
      2.2.6 染色体分析  47-48
      2.2.7 28S rRNA基因序列测定和比对分析  48
  3 结果  48-55
    3.1 原代细胞培养  48-49
    3.2 传代细胞培养  49-50
    3.3 最佳培养条件  50-52
      3.3.1 最佳培养基  50
      3.3.2 最适培养温度  50-51
      3.3.3 最适血清浓度  51-52
    3.4 冷冻保存与复苏  52
    3.5 细胞集落形成效率  52-53
    3.6 染色体数目  53-54
    3.7 28S rRNA基因序列分析与比对  54-55
  4 讨论  55-57
第三章 斑点叉尾鮰出血病的病原分离与鉴定  57-69
  1 前言  57
  2 材料与方法  57-61
    2.1 材料  57-59
      2.1.1 实验鱼  57-58
      2.1.2 细胞系  58
      2.1.3 试剂与耗材  58
      2.1.4 仪器设备  58-59
    2.2 实验方法  59-61
      2.2.1 病鱼寄生虫检查与细菌分离  59
      2.2.2 病鱼组织匀浆液的制备  59
      2.2.3 细胞培养与病毒分离  59-60
      2.2.4 超薄切片电镜观察  60
      2.2.5 病毒基因组分析  60-61
      2.2.6 人工感染试验  61
  3 结果  61-67
    3.1 病鱼症状  61
    3.2 寄生虫检查与细菌分离  61-62
    3.3 病毒培养与分离  62-64
    3.4 电镜观察  64-65
    3.5 病毒基因组分析  65-66
      3.5.1 病毒核酸SDS-PAGE分析  65
      3.5.2 病毒核酸类型鉴定  65-66
    3.6 人工感染试验  66-67
  4 讨论  67-69
第四章 斑点叉尾蛔呼肠孤病毒理化特性与基因组分析  69-77
  1 前言  69
  2 材料与方法  69-72
    2.1 材料  69-70
      2.1.1 细胞系与病毒  69
      2.1.2 试剂与耗材  69-70
      2.1.3 仪器设备  70
    2.2 实验方法  70-72
      2.2.1 细胞培养与病毒培养  70
      2.2.2 病毒理化特性  70-71
      2.2.3 病毒基因组RNA提取  71
      2.2.4 病毒基因组S1～S5节段的克隆与序列分析  71-72
  3 结果  72-75
    3.1 病毒的理化特性  72-73
    3.2 病毒基因组S组基因序列分析  73-75
  4 讨论  75-77
第五章 斑点叉尾鮰出血病细胞培养灭活疫苗研究  77-85
  1 前言  77
  2 材料和方法  77-81
    2.1 材料  77-78
      2.1.1 细胞系与病毒  77
      2.1.2 试剂与耗材  77-78
      2.1.3 仪器设备  78
    2.2 实验方法  78-81
      2.2.1 CCK细胞培养  78
      2.2.2 CCRV-730病毒制备  78
      2.2.3 病毒滴度测定  78-79
      2.2.4 CCRV-730病毒的最佳灭活方法  79
      2.2.5 灭活疫苗的安全性检验  79-80
      2.2.6 灭活疫苗的效果评估  80-81
  3 结果  81-83
    3.1 最佳灭活方法  81-82
      3.1.1 最佳灭活剂量  81
      3.1.2 最佳灭活时间  81-82
    3.2 疫苗的安全性检验  82-83
    3.3 疫苗效果评估  83
      3.3.1 最佳免疫剂量  83
      3.3.2 池塘养殖免疫保护实验  83
  4 讨论  83-85
主要研究结果  85-87
参考文献  87-97
附录  97-106
  1 CCRV-730 S组(S7-S11)基因序列  97-100
  2 CCRV-730 S组基因与其他水生呼肠孤病毒的比对图  100-104
  3 CCRV-730 S组基因进化树  104-106
在读期间发表的相关论文  106
在读期间申请的专利  106-107
致谢  107-108

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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