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草鱼呼肠孤病毒混合感染及其致细胞病变效应的蛋白组学分析

作　者: 王土
导　师: 吕利群
学　校: 上海海洋大学
专　业: 临床兽医学
关键词: GCRV FLAC 混合感染 宿主细胞 蛋白组学分析 亚细胞定位
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)引发草鱼病毒性出血病，是危害性极大的草鱼病原体。该病毒基因组由11条双链RNA组成，共编码7个结构蛋白和5个非结构蛋白。GCRV的感染使宿主细胞出现细胞融合、凋亡、应急颗粒产生等病理变化。全长cDNA测序技术(Full-length amplification of cDNA, FLAC)是dsRNA病毒准确、高效的基因组测序方法，广泛应用于水生呼肠孤病毒基因组研究。双向电泳和质谱鉴定相结合的蛋白组学方法是研究病毒与宿主细胞相互作用机理有效的手段。本文利用FLAC技术、real-time RT-PCR、蛋白组学方法等对以下四个方面进行研究：1.从江西采集的患病草鱼中分离GCRV病毒，利用FLAC技术扩增得到其部分基因的全长cDNA序列，Blast比对显示其分别与GCRV-873和GCRV-GD108同源性为99%，揭示了我国草鱼主要养殖区存在两株同源性较低的GCRV毒株，分别命名为GCRV-JX01和GCRV-JX02；混合感染所占疫情的比例为55%，高于单一毒株感染（30%）。2.通过无限稀释法和RT-PCR分离纯化两株病毒，利用real-time RT-PCR分别比较了两株GCRV单独感染和混合感染时在细胞和上清中的复制效率差异。结果显示：在细胞中，混合感染时GCRV-JX02的复制效率高于单独感染，GCRV-JX01较单独感染时则降低，但两株病毒均能正常复制扩增；在上清中，两株病毒的复制效率较单独感染时无显著变化。鉴于两株病毒进化关系较远，通过鱼体注射灭活疫苗，运用Dot-blot和荧光定量方法监测病毒复制水平，证明针对其中一株病毒产生的抗体不能识别另一株病毒，即两株病毒无免疫交叉保护。3.通过双向电泳技术鉴别宿主细胞（CIK）在GCRV-JX01感染6h、12h和24h后与未感染组的蛋白表达差异点，其中选取23个表达量上调大于3倍的差异点进行质谱鉴定，并归纳了这些蛋白质发挥的生物学功能：细胞骨架（31%）、细胞应激颗粒产生（9%）、信号传导（13%）、能量代谢相关（13%）、泛素化信号通路（17%）和其它未知功能蛋白（17%）。4.克隆GCRV-JX01的NS16、NS31、NS38、VP6和VP7基因，并用Western-blot技术验证其在CIK细胞中的表达。亚细胞定位结果显示：NS31分布于整个细胞，在特定部位高表达；NS16分布于细胞质中，在特定部位高表达；NS38、VP7和VP6均匀分布于细胞质中；单一转染5个重组质粒均不产生明显的细胞病变效应。本研究首次报道了GCRV的混合感染，为混合感染的检测和草鱼出血病流行病学调查提供新方法；对目前免疫防控策略的制定和疫苗的研发提供新思路，对GCRV与宿主细胞相互作用机理和各编码蛋白的生物学功能研究提供参考。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章 文献综述  12-23
  1 草鱼呼肠孤病毒  12-13
  2 GCRV 蛋白质功能的研究  13-15
    2.1 结构蛋白功能的研究  13-14
    2.2 非结构蛋白功能的研究  14-15
  3 GCRV 对宿主细胞生理功能影响的研究  15-17
  4 GCRV 检测及其全基因组测序技术的研究进展  17-20
    4.1 GCRV 检测方法的研究  18-19
    4.2 GCRV 全长 cDNA 测序技术的研究  19-20
  5 蛋白质组学在病毒学研究中的应用  20-22
    5.1 蛋白质组学的研究方法  20-21
    5.2 蛋白质组学在水生动物病毒研究中的应用  21-22
  6 本文研究的目的和意义  22-23
第二章 草鱼呼肠孤病毒混合感染的检测  23-33
  1 材料和方法  23-27
    1.1 仪器与设备  23
    1.2 材料与试剂  23-24
    1.3 所用软件  24
    1.4 试验方法  24-27
      1.4.1 病毒分离  24
      1.4.2 CIK 细胞的传代培养  24
      1.4.3 GCRV 的增殖  24
      1.4.4 病毒基因组（dsRNA）的提取  24-25
      1.4.5 dsRNA3’加接头  25
      1.4.6 dsRNA 连接产物的纯化  25-26
      1.4.7 基因组全长 cDNA 的合成  26
      1.4.8 单引物 PCR 扩增  26
      1.4.9 PCR 产物纯化  26
      1.4.10 T-A 克隆和转化大肠杆菌  26-27
      1.4.11 水生呼肠孤病毒的特异性检测  27
      1.4.12 验证存在 GCRV 的混合感染  27
      1.4.13 序列分析  27
  2 结果与分析  27-32
    2.1 采集病毒样品感染草鱼肾细胞  27-28
    2.2 病毒基因组琼脂糖凝胶分析  28
    2.3 水生呼肠孤病毒 M6 基因的特异性检测  28-29
    2.4 FLAC 技术扩增病毒基因组全长 cDNA  29-30
    2.5 部分基因 cDNA 全长测序结果分析  30
    2.6 GCRV 混合感染的验证  30-31
    2.7 系统进化树的构建  31-32
  3 讨论  32-33
第三章 两株 GCRV 病毒复制效率的比较  33-46
  1 材料和方法  33-37
    1.1 仪器与设备  33
    1.2 材料与试剂  33
    1.3 所用软件  33
    1.4 试验方法  33-37
      1.4.1 两株 GCRV 的分离  33-34
      1.4.2 病毒分离的验证  34
      1.4.3 体外合成 JX01-S10 和 JX02-S11 的 dsRNA  34-35
      1.4.4 Real-time RT-PCR 方法的建立  35
      1.4.5 标准曲线的建立  35
      1.4.6 细胞中复制效率的比较  35
      1.4.7 上清中复制效率的比较  35-36
      1.4.8 流行病学调查样本的检测  36
      1.4.9 GCRV 间交叉免疫的鉴定  36
      1.4.10 GCRV 间血清学反应的鉴定  36-37
  2 结果与分析  37-44
    2.1 GCRV-JX01 和 GCRV-JX02 的分离  37-38
    2.2 病毒分离纯化的鉴定  38-39
    2.3 体外转录模板的扩增  39
    2.4 标准曲线的建立  39-40
    2.5 体内体外复制效率的比较  40-41
    2.6 临床样本的检测结果  41-43
    2.7 毒株间免疫交叉保护的研究  43-44
  3 讨论  44-46
第四章 感染 GCRV-JX01 的 CIK 细胞蛋白质组学分析  46-53
  1 材料和方法  46-48
    1.1 仪器与设备  46
    1.2 材料与试剂  46
    1.3 所用软件  46-47
    1.4 试验方法  47-48
      1.4.1 感染 GCRV 细胞全蛋白的提取  47
      1.4.2 IPG-SDS-PAGE 双向电泳  47
      1.4.3 硝酸银染色  47-48
      1.4.4 图像扫描和分析  48
      1.4.5 胶内酶解及脱盐  48
      1.4.6 质谱分析  48
      1.4.7 数据库检索  48
  2 结果与分析  48-51
    2.1 双向电泳与图谱分析  48-49
    2.2 差异蛋白的质谱鉴定与分析  49-51
  3 讨论  51-53
第五章 GCRV-JX01 部分基因的克隆、表达与亚细胞定位研究  53-62
  1 材料和方法  53-57
    1.1 仪器与设备  53
    1.2 材料与试剂  53
    1.3 所用软件  53
    1.4 试验方法  53-57
      1.4.1 病毒全基因组 cDNA 的合成  53
      1.4.2 基因 ORF 的扩增  53-55
      1.4.3 重组质粒的构建  55
      1.4.4 阳性克隆的筛选和质粒提取  55-56
      1.4.5 转染重组质粒  56
      1.4.6 验证重组质粒在 CIK 细胞中的表达  56-57
      1.4.7 亚细胞定位  57
  2 结果与分析  57-60
    2.1 载体的酶切验证  57
    2.2 基因 ORF 的扩增  57-58
    2.3 重组蛋白在 CIK 中的表达  58
    2.4 重组蛋白在 CIK 中的定位  58-60
  3 讨论  60-62
结论  62-63
参考文献  63-70
附录：论文发表及获奖情况  70-71
致谢  71

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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