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罗非鱼无乳链球菌分子血清型、耐药性以及快速检测方法的建立

作　者: 霍欢欢
导　师: 卢迈新
学　校: 上海海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 罗非鱼无乳链球菌鉴定分子血清型环介导等温扩增快速检测最小抑菌浓度耐药基因
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

2009年以来，我国南方多个罗非鱼主养区连续爆发链球菌病，罗非鱼受感染率与死亡率均较高，个别发病率超过50%，发病鱼死亡率超过95%。链球菌病严重威胁了我国罗非鱼养殖业的健康发展。引起我国南方罗非鱼链球菌病的致病菌主要是无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）。无乳链球菌广泛分布于自然界中，革兰氏阳性，是人、牛和鱼等多种生物的重要致病菌之一。本实验室研究人员赶赴广东与海南省各罗非鱼主养区，采集发病鱼样本，开展了相关研究。本论文内容包括病原菌的分离与鉴定、药物敏感性试验；利用环介导等温扩增技术进行快速检测病原菌；致病菌分子血清型的鉴定；致病菌对喹诺酮类药物最小抑菌浓度的测定以及耐药基因的筛选。研究结果对罗非鱼链球菌病的有效防控、促进罗非鱼养殖业的健康发展具有重要意义。1罗非鱼无乳链球菌分子血清型与耐药性研究为研究罗非鱼无乳链球菌的血清型与耐药性之间的关系，本研究对2010～2011年从海南省各地罗非鱼养殖场中分离到的24株病原菌，采用常规细菌鉴定结果显示，病原菌革兰染色阳性、球形、短链状，β溶血，结合16S rRNA基因鉴定确认24株病原菌均为无乳链球菌。PCR法扩增菌株荚膜多糖(cps)基因鉴定其血清型，表明24株无乳链球菌血清型均为Ⅰa型。采用K-B纸片扩散法检测分离菌株对31种常用抗生素的敏感性，结果表明多数菌株对氨基糖苷类和喹诺酮类药物敏感率低，对强力霉素敏感。对于多数抗生素，2011年分离的菌株敏感率明显低于2010年分离的菌株。本研究表明近两年海南省罗非鱼无乳链球菌分子血清型与菌株耐药性之间无直接相关关系。该结论为罗非鱼无乳链球菌耐药性监测、血清分型及综合防控提供实验依据。2罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测以无乳链球菌溶血因子cfb基因为研究对象，首先针对cfb基因6个区域设计4条特异性引物，采取环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP），并利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）建立环介导等温扩增体系，在65℃恒温温浴1h完成反应，然后向温浴扩增产物中加入SYBRGreenⅠ，通过观察其颜色变化判定结果。利用LAMP方法同时对无乳链球菌、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、浅绿气球菌、变形杆菌以及迟钝爱德华菌进行等温扩增，结果表明所建立的LAMP方法能够特异的检测出无乳链球菌。对LAMP方法的灵敏度进行检测，发现其对纯DNA检测的最低限度为10pg/反应，对纯细菌培养物的最低检测限度为20个/反应。LAMP检测方法的灵敏度是普通PCR方法的10倍以上。表明以cfb作为靶基因所建立的LAMP检测方法具有高度的特异性、敏感性以及稳定性，为罗非鱼无乳链球菌的快速检测提供了新的技术。3罗非鱼无乳链球菌对喹诺酮类的耐药性及与其耐药基因的相关研究为了解罗非鱼无乳链球菌体外对喹诺酮类药物耐药性及与其耐药相关基因gyrA和parC基因突变的关系，本实验通过微量稀释法测定了41株分离菌株对4种喹诺酮类药物的最小抑菌浓度（MIC）值，并克隆了相应菌株体内的gyrA和parC基因测序分析各耐药基因突变情况。结果表明：41株罗非鱼无乳链球菌分离菌株对左氧氟沙星、氟罗沙星、洛美沙星和依诺沙星等4种喹诺酮类抗菌药物的耐药率分别为22.0%、75.6%、73.2%和100%。9株菌对4种喹诺酮类抗菌药物均表现耐药，其中有6株菌发生了氨基酸突变。发生gyrA和parC基因突变的各有3株菌，另外3株菌则未发现突变位点，这说明无乳链球菌对喹诺酮类药物耐药性的产生可能还存在其他耐药机制。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
引言  10-20
  1 鱼类链球菌病国内外研究概况  10-11
  2 鱼类无乳链球菌研究概况  11-12
    2.1 无乳链球菌流行病学研究  11
    2.2 疾病的临床症状  11-12
  3 无乳链球菌的特性  12
  4.无乳链球菌血清型  12-13
  5 无乳链球菌的检测及鉴定  13-16
    5.1 细菌生理生化自动鉴定系统  13
    5.2 16S rRNA 基因序列测定与分析  13
    5.3 环介导等温扩增  13-16
  6 无乳链球菌的耐药性  16-18
    6.1 罗非鱼无乳链球菌耐药现状  16
    6.2 最小抑菌浓度的测定  16-17
    6.3 喹诺酮类抗生素的耐药基因及机制  17-18
  7 本研究目的与意义  18
  8 研究方法及技术路线  18-20
    8.1 研究方法  18-19
    8.2 技术路线  19-20
第一章罗非鱼无乳链球菌血清型及耐药性研究  20-31
  1 材料与方法  20-24
    1.1 病鱼的采集及病原菌的分离纯化  20
    1.2 常用试剂及试剂盒  20
    1.3 培养基的制备  20-21
    1.4 缓冲液的配制  21
    1.5 细菌的生理生化鉴定  21-22
    1.6 细菌 DNA 的提取  22
    1.7 基于 16S rRNA 基因的 PCR 扩增  22-24
    1.8 分子血清分型  24
    1.9 药敏试验  24
  2 结果  24-29
    2.1 菌株形态和生理生化鉴定  24-26
    2.2 16S rRNA 基因鉴定  26
    2.3 血清型鉴定  26-27
    2.4 药敏试验结果  27-29
  3. 讨论  29-31
第二章罗非鱼无乳链球菌 LAMP 快速检测方法的建立  31-38
  1 材料与方法  31-34
    1.1 实验用菌株  31-32
    1.2 试剂及器材  32
    1.3 水煮法提取细菌 DNA  32
    1.4 引物的合成  32-33
    1.5 LAMP 反应  33-34
    1.6 样品检测  34
  2 结果  34-36
    2.1 特异性实验  34-35
    2.2 敏感性实验  35
    2.3 LAMP 荧光实时检测  35-36
    2.4 样品检测  36
  3.讨论  36-38
第三章罗非鱼无乳链球菌对喹诺酮类药物的耐药性与耐药基因相关性研究  38-44
  1 实验材料与方法  38-40
    1.1 菌株  38
    1.2 试剂  38-40
    1.3 最小抑菌浓度的测定  40
    1.4 耐药基因的检测  40
  2 结果  40-42
    2.1 最小抑菌浓度的测定  40-42
    2.2 耐药基因的扩增  42
  3 讨论  42-44
全文总结  44-45
参考文献  45-52
附录  52-55
  附录一缩略词表  52-53
  附录二 LAMP 反应扩增原理  53-54
  附录三在读期间发表论文情况  54-55
致谢  55

罗非鱼无乳链球菌分子血清型、耐药性以及快速检测方法的建立

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