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四川地区斑点叉尾鮰源维氏气单胞菌的耐药性以及耐药基因检测分析

作　者: 赵敏
导　师: 汪开毓
学　校: 四川农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 斑点叉尾鮰 维氏气单胞菌 耐药性 耐药基因 质粒 接合试验
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 45次
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内容摘要


随着我国斑点叉尾鮰养殖规模的不断扩大,各类疾病的频频爆发,给养殖业者造成了重大的损失,同时,养殖业者对抗菌药物的不合理使用,使得病原菌的耐药性进一步加剧,从而又给鱼病的防治带来新的困难。近年来,在斑点叉尾鮰上出现了一种新的病原菌——维氏气单胞菌,该菌对于斑点叉尾鮰的危害极大。因此,开展维氏气单胞菌的耐药性以及耐药基因的检测分析,对指导临床用药和进一步研究该菌的耐药机制都具有重要的意义。2006年到2011年间,本实验室开展了斑点叉尾鮰的流行病学调查工作,从四川地区患病斑点叉尾鮰中分离鉴定出具有致病性的维氏气单胞菌共42株。并采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法,对这42株菌进行了25种抗菌药的药物敏感性测定。结果显示,其对β-内酰胺类的耐药率在7.14%～100%；对四环素耐药率为66.67%,多西环素为57.14%；对氯霉素和氟苯尼考的耐药率均为14.29%；对四种氟喹诺酮类抗菌药耐药率为14.29%-21.42%；对4种大环内酯类抗菌药耐药率为4.76%～23.81%；出现了11种耐药类型,分别是3耐、4耐、5耐、6耐、7耐、8耐、9耐、10耐、11耐、12耐和20耐。其中,4耐、6耐、8耐和9耐类型分布最广,分别是16.67%、14.29%、14.29和14.29%。采用PCR法进一步扩增了四环素耐药基因tet A、tet B、 tet C、tet D和tet E,酰胺醇类耐药基因flo R、cat A和cml A,以及质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnr A、 qnr B和qnr S,并检测了喹诺酮类药物耐药决定区的氨基酸突变情况。结果显示,在42株维氏气单胞菌中检测到tet A、tet B、tet C、tet E、flo R和qnr S基因,检出率分别为38.10%(16/42)、4.76%(2/42)、9.52%(4/42)、4.76%(2/42)、14.29%(6/42)和35.71%(15/42)；并在8株菌中同时检测到Gyr A第83位以及Par C第87位氨基酸由Ser突变为Ile。通过对耐药菌株抽提质粒以及对质粒进行PCR扩增发现,在提取出的质粒中存在tet A和qnr S基因。采用接合试验,证明了维氏气单胞菌中携带的耐药质粒能够进行水平传播。接合子与受体菌大肠杆菌J53相比,对四环素类和喹诺酮类药物的耐药性升高。综上所述,本次在四川地区分离的维氏气单胞菌对于25种抗菌药的耐药性很严重,且存在多重耐药情况；对耐药基因进行PCR扩增的结果与耐药表型存在一定的相关性；接合试验表明,维氏气单胞菌携带的耐药质粒可以进行水平转移。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
英文缩略词表  8-13
第一章 文献综述  13-21
  1 维氏气单胞菌的耐药现状  13-15
  2 细菌的耐药机制  15-21
    2.1 细菌对四环素类的耐药机制  15-17
    2.2 细菌对喹诺酮类的耐药机制  17-19
    2.3 细菌对酰胺醇类的耐药机制  19-21
第二章 本研究的目的和意义  21-22
第三章 维氏气单胞菌耐药表型检测  22-34
  1 试验材料  22-24
    1.1 试验菌株以及标准菌株  22
    1.2 抗菌药物  22-23
    1.3 试验试剂  23
    1.4 主要仪器和设备  23-24
  2 试验方法  24-26
    2.1 细菌复苏与培养  24
    2.2 微量肉汤稀释法测定维氏气单胞菌的MIC值  24-25
    2.3 纸片扩散法测定维氏气单胞菌的药物敏感性  25-26
  3 结果与分析  26-31
    3.1 维氏气单胞菌分离株对部分抗菌药的MIC结果与分析  26-28
    3.2 维氏气单胞菌对25种抗菌药的药敏结果和分析  28-29
    3.3 维氏气单胞菌分离株的多重耐药性分析  29-31
  4 讨论  31-34
    4.1 药敏试验方法  31-32
    4.2 维氏气单胞菌的耐药情况  32-33
    4.3 合理使用抗菌药  33-34
第四章 维氏气单胞菌四环素类、酰胺醇类及氟喹诺酮类耐药基因以及喹诺酮类药物耐药决定区突变的检测分析  34-57
  1 材料  34-35
    1.1 试验菌株  34
    1.2 培养基及缓冲溶液配制  34
    1.3 分子生物学试剂  34
    1.4 主要仪器设备  34-35
  2 方法  35-39
    2.1 菌株的培养与细菌基因组DNA的提取  35
    2.2 引物设计与合成  35-38
    2.3 目标基因的PCR扩增  38
    2.4 PCR产物电泳及目的基因片段的回收  38-39
    2.5 目的基因片段的连接、转化与克隆测序  39
  3 结果与分析  39-52
    3.1 四环素类耐药基因的检测结果与分析  39-44
    3.2 酰胺醇类耐药基因的检测结果与分析  44-46
    3.3 喹诺酮类药物耐药决定区基因突变点检测  46-49
    3.4 质粒介导的喹诺酮类耐药基因检测结果与分析  49-50
    3.5 维氏气单胞菌中携带多种耐药基因的情况分析  50-52
  4 讨论  52-57
    4.1 维氏气单胞菌对四环类药物的耐药机制  52-53
    4.2 维氏气单胞菌对酰胺醇类药物的耐药机制  53-54
    4.3 维氏气单胞菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制  54-57
第五章 耐药质粒提取以及耐药基因水平转移研究  57-64
  1 材料  57-58
    1.1 试验材料  57-58
  2 方法  58-60
    2.1 质粒提取  58
    2.2 质粒上耐药基因的检测  58
    2.3 耐药质粒水平转移研究  58-59
    2.4 提取接合子质粒进行耐药基因的检测  59
    2.5 大肠杆菌J53以及接合子的MIC值的测定  59-60
  3 结果与分析  60-62
    3.1 质粒提取以及耐药基因检测结果  60
    3.2 接合试验结果与分析  60-61
    3.3 大肠杆菌J53和接合子MIC值结果与分析  61-62
  4 讨论  62-64
第六章 结论和创新  64-65
  1 结论  64
  2 创新点  64-65
参考文献  65-73
致谢  73-74
附录  74-75
  附录一  74-75
  附录二  75
  附录三  75

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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