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海豚链球菌cpsD基因的克隆、原核表达及基于cpsD基因的间接原位PCR方法的建立

作　者: 王浩丞
导　师: 汪开毓
学　校: 四川农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 海豚链球菌 cpsD基因克隆分子特性分析原核表达间接原位PCR
分类号: S941.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

从1976年海豚链球菌首次从淡水海豚上分离报道以来,其不但逐渐成为危害世界水产养殖业的主要病原菌,而且近年来关于海豚链球菌感染人的报道时有可见,海豚链球菌病成为了一种世界范围内的人和鱼类的共患疾病,引起了越来越多的人对该菌的关注和研究。本研究对分离自患病斑点叉尾鮰的海豚链球菌DGX07菌株(GenBank登录号为FJ951434),运用分子生物学方法开展该致病菌的功能基因cpsD的分子特性、原核表达及其在间接原位PCR检测方法的研究,旨在为进一步开展海豚链球菌cpsD基因的功能等研究提供基础实验数据,并为病原菌的分子生物学特性研究、致病机理等提供指导性意义,从而为海豚链球菌的疫苗的发展奠定坚实的基础。1.海豚链球菌链球菌cpsD基因的克隆、鉴定及分子特性分析对海豚链球菌分离株DGX07cpsD基因进行克隆和鉴定,运用生物信息学软件对cpsD基因进行分子特性分析。结果显示：海豚链球菌分离株cpsD基因大小为720bp,为一个完整ORF,编码239个氨基酸,具有1个三磷酸核苷酸水解酶的保守结构域；该推导氨基酸序列具有高度保守性,与其它海豚链球菌菌株的相似性为100%；编码多肽链中疏水区多于亲水区,不含有跨膜区和信号肽,具有潜在的磷酸化位点多达22个,潜在的糖基化位点1个。密码子偏爱性分析结果显示：海豚链球菌cpsD基因偏爱第三位碱基为T或者A碱基的密码子,与大肠杆菌、酵母和人的密码子使用频率差异分别有33、26和31个。2.海豚链球菌cpsD基因的原核表达和多克隆抗体的制备构建重组表达质粒pET-32a(+)-cpsD,转化到大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS,使用IPTG诱导cpsD基因的原核表达。经SDS-PAGE分析显示,重组蛋白的大小约46KDa,表达产物主要以包涵体的形式存在；最佳表达条件为0.6mmol/LIPTG终浓度在37℃下诱导5h。利用纯化的重组蛋白免疫家兔,制备了海豚链球菌CpsD多克隆抗体。Western Blot检测显示CpsD重组蛋白具有良好的反应原性；琼脂扩散试验分析显示制备的兔抗CpsD重组蛋白多克隆抗体的免疫效价达1：16。3.间接原位PCR检测海豚链球菌感染斑点叉尾鮰组织分布以海豚链球菌分离株DGX07菌株LD5o剂量腹腔注射斑点叉尾鮰,设计海豚链球菌cpsD基因特异性引物和寡核苷酸探针并建立间接原位PCR方法研究海豚链球菌在感染斑点叉尾鮰组织细胞的分布规律。结果表明：感染后4h时,在斑点叉尾鮰的肝脏和脾脏中首先检测到少量的阳性信号；感染后8h时,在斑点叉尾鮰的肾脏开始检测到阳性信号；感染后24h时,在鳃、心、眼球和脑组织检测到阳性信号,在肝脏、脾脏、肾脏可检测大量阳性信号分布。

全文目录

中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
符号说明  7-8
目录  8-11
第一章文献综述及选题目的和意义  11-17
  第一节海豚链球菌的研究概述  11-16
    1. 海豚链球菌的基本特性及危害  11-12
      1.1 海豚链球菌的基本特性  11
      1.2 海豚链球菌的危害  11-12
    2. 海豚链球菌主要毒力因子及其致病性  12-13
    3. 海豚链球菌荚膜多糖毒力因子CpsD研究进展  13-16
      3.1 海豚链球菌荚膜多糖的基因序列的特征  13
      3.2 海豚链球菌荚膜多糖的功能  13-15
      3.3 海豚链球菌毒力因子CpsD  15-16
  第二节选题的目的和意义  16-17
第二章试验研究  17-72
  第一节海豚链球菌cpsD基因的克隆、鉴定及分子特性分析  17-38
    1. 试验材料  17-18
      1.1 菌株及载体  17
      1.2 主要试剂  17
      1.3 主要溶液及培养基的配置  17-18
      1.4 主要仪器设备  18
    2. 试验方法  18-23
      2.1 特异性引物的设计  18
      2.2 海豚链球菌基因组DNA的提取  18
      2.3 cpsD基因的PCR扩增  18-19
      2.4 cpsD基因的T克隆与鉴定  19-22
      2.5 核酸序列特征分析  22
      2.6 蛋白质序列特征分析  22
      2.7 密码子偏爱性分析  22-23
    3. 结果与分析  23-35
      3.1 海豚链球菌cpsD基因的PCR扩增和T-克隆鉴定  23-24
      3.2 核苷酸序列分子特性分析  24
      3.3 蛋白质序列的分子特性分析  24-32
      3.4 密码子偏爱性分析  32-35
    4. 讨论  35-38
      4.1 cpsD基因的引物设计和克隆  35-36
      4.2 cpsD基因的分子特性  36-37
      4.3 密码子偏爱性对蛋白表达的影响  37-38
  第二节海豚链球菌cpsD基因的原核表达及多克隆抗体制备  38-55
    1. 试验材料  38-41
      1.1 菌株及载体  38
      1.2 主要试剂  38
      1.3 主要溶液及培养基的配置  38-41
      1.4 主要仪器设备  41
    2. 试验方法  41-46
      2.1 cpsD基因重组质粒表达菌株的构建  41-43
      2.2 重组表达质粒转化入BL21(DE3)/pLysS表达宿主菌及鉴定  43-44
      2.3 重组蛋白的诱导表达及条件优化  44-45
      2.4 重组蛋白的纯化  45
      2.5 兔抗CpsD多克隆抗体的制备  45-46
    3. 结果与分析  46-51
      3.1 重组表达质粒pET-32a(+)-cpsD鉴定  46-47
      3.2 重组蛋白的诱导表达及条件优化  47-50
      3.3 重组蛋白的纯化  50
      3.4 免疫兔血清的Western-blot检测  50-51
      3.5 琼脂扩散试验效价的检测  51
    4. 讨论  51-55
      4.1 外源基因的表达  51-52
      4.2 诱导条件的优化  52-53
      4.3 包涵体的形成  53-54
      4.4 兔抗CpsD重组蛋白血清的制备  54-55
  第三节间接原位PCR检测海豚链球菌感染斑点叉尾鮰组织分布  55-72
    1. 试验材料  55-56
      1.1 试验菌株  55
      1.2 试验动物  55
      1.3 主要试剂  55
      1.4 主要仪器  55
      1.5 主要溶液及培养基配制  55-56
    2. 试验方法  56-61
      2.1 饲养管理  56
      2.2 菌株培养  56-57
      2.3 斑点叉尾鮰的人工感染S. iniae-DGX07菌株试验  57
      2.4 引物及特异性探针的设计和合成  57
      2.5 寡核苷酸的探针稀释  57
      2.6 间接原位PCR方法检测海豚链球菌在组织中的分布  57-60
      2.7 结果判定  60
      2.8 间接原位PCR反应条件优化  60-61
      2.9 间接原位PCR特异性试验  61
    3. 结果与分析  61-64
      3.1 引物及探针的特异性  61-62
      3.2 间接原位PCR条件优化  62
      3.3 间接原位PCR特异性试验  62-63
      3.4 间接原位PCR检测海豚链球菌在斑点叉尾鮰体内的分布规律  63-64
    4. 讨论  64-68
      4.1 间接原位PCR的应用  64
      4.2 间接原位PCR的影响因素  64-66
      4.3 海豚链球菌在斑点叉尾鮰体内的分布规律  66-68
    图版Ⅰ间接原位PCR检测海豚链球菌  68-72
参考文献  72-78
致谢  78

海豚链球菌cpsD基因的克隆、原核表达及基于cpsD基因的间接原位PCR方法的建立

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