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海水弧菌耐药性I类整合子分析与副溶血弧菌分子分型研究

作　者: 李林桂
导　师: 房文红
学　校: 四川农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 弧菌 耐药性 Ⅰ类整合子 多位点序列分型
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


弧菌属于弧菌科弧菌属,是一类革兰氏阴性、具鞭毛、能运动的无芽孢短杆状细菌,是海洋中最常见的细菌类群之一,广泛分布于近海岸、河口海区海水和生物体中,其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大,是一类条件致病菌,一旦大面积爆发将威胁海水养殖业健康发展。其中的副溶血弧菌更是作为一种重要的人畜共患病原菌,是沿海地区夏、秋季食物中毒和急性腹泻的主要病原菌之一。为了解我国海水养殖中弧菌的耐药性与副溶血弧菌种群构成情况,本文通过TCBS培养基筛选、生化鉴定结合HSP60基因序列比对的方法,从我国浙江、海南、江苏和福建海水养殖水体和患病动物中分离得到了214株弧菌,其中副溶血弧菌82株,溶藻弧菌47株,哈维氏弧菌45株,·创伤弧菌27株,其他种类弧菌13株,在对菌株来源地域与分离物种分析后,主要进行了以下几项研究：1、耐药性分析采用改良K-B法测定了214株弧菌对9类共15种抗生素的敏感性。结果显示,分离菌株对青霉素类青霉素和新生霉素的敏感性低,其中对青霉素敏感性最低,仅待有6.5%的菌株对其敏感；对利福平类利福平、大环内酯类的红霉素以及氨基糖苜类的卡那霉素和链霉素敏感的菌株比例均低于17%;对磺胺类复方新诺明和头孢菌素类头孢曲松钠敏感性较高；氟喹诺酮类中,诺氟沙星的敏感性高于恩诺沙星;四环素类中,多达99%的菌株对强力霉素和土霉素表现为敏感；所有菌株对氯霉素类的氟苯尼考敏感,对氯霉素敏感的菌株也达98.1%。多药耐药分析表明,耐3种抗生素及以上耐药的菌株占49.1%；耐药4种及以上的菌株占27.1%,耐药5种及以上占12.1%,耐药6种占3.3%,菌株最多耐6种抗生素。6耐(耐6种抗生素)出现了2株耐药谱型为“新生霉素／青霉素／利福平／红霉素／恩诺沙星／四环素”的菌株,5耐以“新生霉素／青霉素／利福平／红霉素／恩诺沙星”谱型最为常见,4耐和3耐最多的分别是“新生霉素／青霉素／利福平／红霉素”和“青霉素／利福平／红霉素”谱型。从分离地域来看,不同省份分离菌株耐药性表现出一定的地域差异。2、典型Ⅰ类整合子-基因盒分析采用PCR方法和T-A克隆测序对分离菌株Ⅰ类整合子整合酶基因、3’端保守区qacE△1和Sul Ⅰ基因及可变区的耐药基因盒进行了检测和鉴定。214株弧菌中有6株检测为整合酶阳性,仅有一株创伤弧菌3’端保守区检测为阳性,对该菌株可变区扩增获得了arr-3—dfrA27结构的耐药基因盒,分别介导利福平和甲氧苄啶耐药。耐药性与整合子相关性分析表明,弧菌整合子与耐药表型有一定相关性,但并不是绝对相关。本文首次明确了海水养殖弧菌中存在Ⅰ类整合子,首次在创伤弧菌中发现了典型的Ⅰ类整合子-基因盒,并首次向GenBank提交了创伤弧菌Ⅰ类整合子序列。3、副溶血弧菌分子分型采用多位点序列分型技术对分离的82株副溶血弧菌进行分子分型。PCR扩增毒力基因TDH、TRH、T3SS1(4个基因)和T3SS2(2个基因)的结果表明,82株副溶血弧菌TDH、TRH和T3SS2检测结果均为阴性,有4株菌株T3SS1检测阴性,其余菌株至少携带T3SS1所测4个毒力基因中的2个,说明该系统在副溶血弧菌中普遍存在。MLST分型结果显示,等位基因比对发现了32个新的等位基因型；82株副溶血弧菌分为44种ST型,其中新获得ST型有38种；ST型聚类分析中,仅有7个ST型能分为3个群体,其余ST型均为独特型,说明分离菌株表现出较高的遗传多样性。本文进一步明确,通过分析大量的世界各地分离的菌株信息,多位点序列分型对促进副溶血弧菌流行病学调查和遗传图谱的制作意义重大。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-7
符号说明  7-12
第一部分 文献综述及目的意义  12-18
  1 文献综述  12-16
    1.1 弧菌及弧菌病简介  12-13
    1.2 海水养殖弧菌耐药现状  13-14
    1.3 细菌的耐药性  14-15
      1.3.1 细菌耐药机制  14
      1.3.2 整合子-基因盒介导的耐药及其在弧菌中的研究  14-15
    1.4 副溶血弧菌的分子分型研究  15-16
      1.4.1 副溶血弧菌毒力因子  15
      1.4.2 副溶血弧菌多位点序列分型  15-16
  2 本论文研究的目的意义  16-18
第二部分 论文实验  18-62
  第一章 细菌分离培养、鉴定与保存  18-27
    1 材料与方法  18-20
      1.1 材料  18-19
        1.1.1 水样与病样  18
        1.1.2 主要试剂  18-19
        1.1.3 主要仪器  19
        1.1.4 引物  19
      1.2 方法  19-20
        1.2.1 分离培养  19-20
        1.2.2 模板的制取和HSP60基因鉴定细菌  20
        1.2.3 琼脂糖凝胶电泳和序列处理  20
    2 结果与分析  20-23
      2.1 弧菌属HSP60基因构建系统进化树  20-21
      2.2 分离菌株构成分析  21-23
        2.2.1 分离菌株种群分析  22
        2.2.2 分离菌株来源地域分析  22-23
        2.2.3 分离菌株在养殖品种中的分布情况  23
    3 结论与讨论  23-26
      3.1 分离培养与菌种鉴定  23-25
        3.1.1 分离培养  23-24
        3.1.2 菌种鉴定  24-25
      3.2 分离菌株组成分析  25-26
        3.2.1 弧菌组成与地域的相关性  25
        3.2.2 弧菌组成与养殖品种的相关性  25-26
    4 本章小结  26-27
  第二章 分离菌株耐药性检测  27-36
    1 材料与方法  27-28
      1.1 材料  27-28
        1.1.1 菌株  27
        1.1.2 培养基与药敏纸片  27-28
        1.1.3 质控菌株  28
        1.1.4 主要仪器  28
      1.2 方法  28
    2 结果与分析  28-33
      2.1 药敏试验结果  28-29
      2.2 分离菌株对15种抗生素的耐药谱分析  29-33
    3 结论与讨论  33-35
      3.1 抗菌药物敏感性的实验方法  33
      3.2 我国养殖弧菌耐药情况现状及流行趋势  33-35
        3.2.1 从总体耐药性看弧菌耐药情况  33-34
        3.2.2 从耐药谱方面看弧菌耐药情况  34
        3.2.3 从不同省份分离菌株看弧菌耐药情况  34-35
      3.3 抗生素的合理使用  35
    4 本章小结  35-36
  第三章 分离弧菌典型Ⅰ类整合子-基因盒的检测  36-48
    1 材料与方法  36-40
      1.1 材料  36-38
        1.1.1 菌株  36-37
        1.1.2 试剂  37
        1.1.3 主要仪器  37
        1.1.4 引物  37-38
      1.2 方法  38-40
        1.2.1 模板的制取和扩增整合子PCR体系  38
        1.2.2 琼脂糖凝胶电泳及目的条带的回收  38
        1.2.3 目的片段与载体的连接  38-39
        1.2.4 感受态的制备  39
        1.2.5 重组质粒的转化与阳性菌株的筛选  39-40
        1.2.6 测序与序列分析  40
        1.2.7 整合子-基因盒可变区的扩增  40
    2 结果与分析  40-44
      2.1 整合子5'整合酶和3'端保守区扩增  40-43
        2.1.1 保守区扩增结果统计  40-41
        2.1.2 扩增电泳图  41
        2.1.3 测序结果与序列分析  41-43
      2.2 耐药基因盒的检测  43-44
    3 讨论与结论  44-47
      3.1 整合子-基因盒的检测技术  45
      3.2 耐药表型与整合子-基因盒的检测  45-46
      3.3 海水养殖创伤弧菌中首次发现完整的Ⅰ类整合子  46-47
    4 本章小结  47-48
  第四章 副溶血弧菌分子分型研究  48-62
    1 材料与方法  48-51
      1.1 材料  48-50
        1.1.1 菌株  48-49
        1.1.2 试剂  49
        1.1.3 主要仪器  49
        1.1.4 引物  49-50
      1.2 方法  50-51
        1.2.1 菌株基因组DNA的提取  50
        1.2.2 PCR扩增MLST分型基因  50
        1.2.3 MLST分型序列分析  50-51
        1.2.4 PCR扩增副溶血弧菌毒力基因  51
    2 实验结果  51-58
      2.1 毒力基因检测  51-52
        2.1.1 毒力基因扩增结果  51-52
        2.1.2 毒力基因检测结果统计  52
      2.2 MLST分型结果  52-56
        2.2.1 MLST扩增结果  52-53
        2.2.2 等位基因获取结果  53
        2.2.3 菌株的ST型获取结果  53-56
      2.3 副溶血弧菌分型聚类分析  56-58
        2.3.1 BURST在线分析结果  56-57
        2.3.2 SplitsTree建树结果  57-58
        2.3.3 Tree drawing建树结果  58
    3 结论与讨论  58-61
      3.1 副溶血弧菌的毒力基因  58-59
      3.2 MLST在细菌分型中的应用  59-60
      3.3 分离副溶血弧菌的MLST  60-61
    4 本章小结  61-62
第三部分 全文总结  62-63
参考文献  63-70
致谢  70-71
攻读学位期间发表的学术论文目录  71

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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