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南方草鱼呼肠孤病毒流行病学调查及双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

作　者: 杨映
导　师: 颜其贵
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 草鱼呼肠孤病毒流行病学序列分析双重荧光定量RT-PCR
分类号: S941.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖的四大家鱼之一,尤其在我国气候温暖的南方如长江、珠江水域养殖量极大。在草鱼养殖最常见的疾病当中,威胁最大的就是草鱼出血病,其死亡率可高达90%,造成严重的经济损失。该病主要危害长度10cm左右的当年生草鱼鱼种,病原为草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Repvirus, GCRV),其基因组由11条分阶段的dsRNA组成。目前,针对该病暂时还没有有效的治疗手段,被普遍用于控制该病的方法就是利用疫苗来进行免疫防御。因此,为了能筛选出免疫原性强的毒株,必须针对一定养殖范围进行准确的流行病学调查和分析。在最近的研究报道中,我们获知目前在我国发现的GCRV有两种差异较大的毒株类型,其中一类是早期发现并研究较多的以GCRV-873株为代表的传统型,另一类是以近年来才完成全基因测序的GCRV GD-108株为代表的新型毒株。1.流行病学调查与VP6蛋白基因变异分析本研究收集了2011年至2012年间,湖北、湖南、江西、江苏、广东等五个省多个大型草鱼渔场的草鱼出血病疑似病例,分别根据GCRV GD-108株L2基因、GCRV-873株S6基因序列设计特异性检测引物进行RT-PCR诊断,对60个批次的216份草鱼样品进行检测。检测结果显示：共有84份阳性病料被检出,总阳性检出率为38.9%,全部为新型GCRV;其中一份病料用两种引物检测结果均为阳性,怀疑为新型和传统型GCRV混合感染。为进行深入研究,我们筛选出8个具有一定代表性的新型毒株感染的样品进行病毒分离,在成功转染草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idellus Kidney, CIK)后盲传3代未发现有明显的细胞病变(Cytopathic effect,CPE)。将病毒感染后的细胞固定后进行透射电镜观察和拍片,结果观察到在CIK细胞的胞质内有大量病毒粒子呈晶格状排布,未观察到囊膜结构,病毒颗粒近似六边形,直径大小为70nm左右,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒相符合。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果显示,病毒基因组由11条分节段的RNA组成,具有水生呼肠孤病毒基因组的典型特征,但各个片段大小与传统型GCRV的有明显差别。另设计一对特异性引物扩增该8株新型GCRV的VP6蛋白基因并进行序列分析。VP6蛋白基因全长均为1257bp,未发现基因缺失或插入,编码418个氨基酸,同类型毒株之间核苷酸序列同源性为97.1-100%,氨基酸序列同源性为97.6-100%,相对保守。然而与经典株GCRV-873比对则表现出极大的变异,核苷酸和氨基酸同源性分别只有39.6-40.1%和21.6-22.5%。利用对流免疫技术和抗原表位分析从不同层面上得出相似结论,新型毒株与经典株之间无交叉抗原保护性。本研究揭示了新型呼肠孤病毒是目前南方地区主要的草鱼出血病流行毒株,且与传统型GCRV之间无交叉抗原保护性,因此在对该病的防治研究中应引起重视。2.双重实时萤光定量RT-PCR检测方法的建立从多对引物中筛选出两对合适的引物,通过对引物浓度和PCR条件的优化,我们建立了GCRV双重实时荧光定量RT-PCR检测方法。该检测方法具有良好特异性,仅对当前流行的两种草鱼呼肠孤病毒的检测结果为阳性,而对番鸭呼肠孤病毒MDRV、传染性造血器官坏死病毒IHNV、禽呼肠孤病毒ARV的检测结果均为阴性;同时该方法对两种类型的GCRV检测灵敏度均达到10copies/μL的数量级浓度,比常规PCR检测灵敏度高100倍。组内重复和组间重复试验结果显示,该检测方法的变异系数均不超过1.2%,重复性和稳定性好。对50份草鱼出血病临床样品进行检测,荧光定量检测方法的表现出比常规PCR检测更加可靠准确：常规RT-PCR检测仅能检测出40份阳性病料,阳性检出率为80%,而用该双重实时荧光定量RT-PCR检测方法则能检测出42份阳性病料,阳性检出率为84%,并且对混合感染病料也能通过荧光信号进行检测。该结果显示用双重实时荧光定量RT-PCR检测方法不仅能完全检测出常规PCR检测呈阳性的样品,并且对一些病毒含量极低的,用普通PCR无法检测出的样品,也能被该方法准确地检测,阳性检出率提高了4%。该检测方法不仅具有普通荧光定量RT-PCR的各种优点：特异性强、灵敏度高、重复性好,而且仅通过一次反应即可同时检测和鉴别出新型GCRV和传统型GCRV,可用于草鱼呼肠孤病毒早期诊断、定量分析以及流行病学监测,并且还能区分其病毒类型,更好地指导该病的防治工作。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
符号说明  8-9
目录  9-13
第一章文献综述  13-21
  前言  13
  1. 草鱼呼肠孤病毒的研究进展  13-17
    1.1 草鱼呼肠孤病毒研究概况  13-14
    1.2 GCRV的形态结构  14-15
    1.3 GCRV基因组结构和功能分析  15
    1.4 GCRV理化性质与培养特性研究  15-16
    1.5 病理组织学研究  16-17
    1.6 免疫原性研究  17
  2 草鱼呼肠孤病毒检测方法研究进展  17-19
    2.1 草鱼出血病临床诊断  17-18
    2.2 GCRV的实验室检测  18-19
  3 草鱼出血病的防治  19-20
  4 本研究的目的与意义  20-21
第二章南方草鱼呼肠孤病毒流行病学调查  21-46
  1. 材料和方法  21-31
    1.1 实验材料  21-23
      1.1.1 实验材料、试剂和试剂盒  21
      1.1.2 所用溶剂及其器具  21-22
      1.1.3 主要实验仪器  22-23
    1.2 样品采集及处理  23
    1.3 引物设计与合成  23-24
    1.4 病毒的分离与传代培养  24-28
      1.4.1 草鱼出血病病料检测  24-28
        1.4.1.1 病毒RNA的提取  24
        1.4.1.2 病毒RNA反转录  24-25
        1.4.1.3 反转录产物PCR  25
        1.4.1.4 琼脂糖凝胶电泳  25
        1.4.1.5 PCR产物的纯化  25-26
        1.4.1.6 连接反应  26
        1.4.1.7 感受态细胞的制备  26-27
        1.4.1.8 重组质粒的转化  27
        1.4.1.9 重组质粒的提取  27
        1.4.1.10 重组质粒的测序  27-28
      1.4.2 病鱼组织匀浆除菌上清液的制备  28
      1.4.3 病毒分离培养  28
    1.5 病毒的鉴定  28-29
      1.5.1 电镜观察  28-29
      1.5.2 病毒基因组的SDS-PAGE  29
    1.6 草鱼感染试验  29
      1.6.1 草鱼的驯养  29
      1.6.2 病毒回归草鱼试验  29
    1.7 病毒VP6蛋白基因变异分析  29-30
      1.7.1 目的基因的RT-PCR扩增  29
      1.7.2 克隆与测序  29-30
      1.7.3 序列比对及分析  30
    1.8 GCRV的抗原保护性初步研究  30-31
      1.8.1 单抗血清的获得  30
      1.8.2 对流免疫电泳试验  30-31
      1.8.3 草鱼保护实验  31
  2. 结果与分析  31-43
    2.1 流行病学调查结果  31-33
    2.2 RT-PCR检测结果  33-34
    2.3 病毒分离培养结果  34-36
    2.4 新型GCRV的电镜观察  36-37
    2.5 病毒基因组SDS-PAGE结果  37-38
    2.6 草鱼回归感染试验结果  38-39
    2.7 序列分析和比对  39-40
    2.8 系统进化树  40-41
    2.9 VP6蛋白抗原表位  41-42
    2.10 对流免疫电泳与草鱼保护试验  42-43
  3. 讨论  43-46
第三章 GCRV双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立  46-59
  1. 材料和方法  46-49
    1.1 病毒、细胞与临床样品  46
    1.2 试剂与仪器  46
    1.3 引物的设计与筛选  46-47
    1.4 阳性标准质粒的制备  47
    1.5 荧光定量PCR反应条件优化  47-48
    1.6 反应标准曲线的建立  48
    1.7 荧光定量PCR检测方法的评价  48-49
      1.7.1 特异性试验  48
      1.7.2 敏感性试验  48
      1.7.3 重复性试验  48-49
    1.8 临床样品的检测  49
  2. 结果与分析  49-56
    2.1 cDNA模板PCR扩增结果  49-50
    2.2 重组质粒的PCR鉴定  50
    2.3 重组质粒拷贝数测定  50
    2.4 双重荧光定量PCR反应条件的确定及标准曲线的建立  50-52
    2.5 定量RT-PCR的熔解曲线  52
    2.6 特异性试验结果  52-53
    2.7 敏感性试验结果  53-55
    2.8 重复性试验结果  55-56
    2.9 临床样品的检测  56
  3. 讨论  56-59
参考文献  59-66
致谢  66-67
附录  67-69
攻读学位期间发表的学术论文目录  69

南方草鱼呼肠孤病毒流行病学调查及双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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