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利用Genome shulffling技术提高海洋链霉菌抗菌物质活性的研究

作　者: 李春燕
导　师: 陆兆新
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品工程
关键词: 海洋链霉菌基因组重排灭活原生质体融合发酵优化
分类号: S917.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

海洋中蕴藏着大量的微生物资源,在它们中广泛地分布着抗菌活性菌株,是抗菌物质的重要潜在来源。本课题组从连云港海域潮间带采集的样品中筛选得到的1株产广谱、高活性抗菌物质的放线菌。该菌对5种革兰氏阳性菌、4种革兰氏阴性菌及18种真菌有显著拮抗作用。研究表明,该菌在生防、食品及医药方面有潜在的应用价值。但野生菌株的产量相对较低,不能满足工业化要求,实验室前期经化学诱变、抗生素诱变和N离子束注入诱变,该菌株的发酵产量有了很大的提高,具有潜在的工业应用价值。为了进一步提高海洋链霉菌的发酵水平,本研究运用双亲灭活原生质体融合技术,选择海洋链霉菌GB-2经不同诱变处理筛选得到的两株高产菌株streptomyces s p. FMBL-42和streptomyces sp. FMBL-43为亲本,进行了融合研究；并对稳定高产的融合子进行了发酵条件优化的研究。主要研究结果如下：1.确定了菌丝体培养条件。通过菌丝体在YEME培养和S培养中菌丝生长量的测定,结果显示,两亲本在YEME培养基中生长迅速,菌丝体产量高；在S培养基中,两亲本的生长量很低,不利于菌丝体的大量生长；FMBL-43和FMBL-42培养基中GLY的添加量分别为0.5%、1.0%,产生的菌丝量合适,且菌丝体较为敏感；FMBL-43和FMBL-42培养基中蔗糖添加量分别为20%、20%,菌丝体生长量最多,且松散效果最好。确定了最佳的酶条件及灭活条件。通过对菌丝体在不同酶处理后再生数和再生率的测定,结果显示,蜗牛酶对两亲本几乎没有破壁效果,溶菌酶破壁率较高；酶浓度的研究结果显示,FMBL-43和FMBL-42合适的溶菌酶添加浓度分别为3mg/mL、4mg/mL,该条件下,原生质体的再生数再和生率最高；酶解时间的研究结果显示,FMBL-43和FMBL-42合适的酶解时间分别为2.Oh、1.5h,此时原生质体的再生数和再生率最高；紫外灭活结果显示,在15W紫外照射下,致死率为100%时,两亲本的灭活时间均为180min；热灭活结果显示,致死率为100%时,两亲本的灭活温度均为100℃,处理5min。筛选出了稳定高产的融合子。通过初筛、复筛筛选出了9株高产融合子,分别命名为PF-1、PF-2、PF-3、PF-4、PF-5、PF-6、PF-7、PF-8、PF-9。传代稳定性研究结果表明,有5株融合子的发酵产量高、稳定性好,分别为PF-1、PF-2、PF-4、PF-5、PF-6,产量最高的融合子PF-1比亲本FMBL-43提高了65.84%。2、确定了最优的发酵培养基。通过对不同碳源筛选,结果显示,小麦粉和麦芽浸粉为合适的碳源；通过对缓效氮源和速效氮源的筛选,结果表明,高温压榨黄豆饼粉和蛋白胨为合适的氮源；通过对无机盐种类的筛选,结果表明,MgSO4CaCO3为合适的无机盐离子。对培养基组分单因素实验,结果显示,小麦粉选取20g/L-40g/L为后续部分析因实验的高、低水平取值范围；麦芽浸粉选取2.5g/L-5g/L为后续部分析因实验的高、低水平取值范围；黄豆饼粉选取20g/L-40g/L为后续部分析因实验的高、低水平取值范围；蛋白胨选取1.25g/L-2.5g/L为后续部分析因实验的高、低水平取值范围；无机盐离子钙离子、镁离子、亚铁离子、钴离子合适的取值范围分别为3g/L-6g/L、24g/L-48g/L、7.5×10-4g/L-15×10-4g/L、0.75×10-3g/L-6x10-3g/L。通过部分因子筛选实验,结果显示,Streptomyces sp.PF-1培养基的显著影响因素是黄豆饼粉、小麦粉和硫酸镁。最陡爬坡实验结果显示,黄豆饼粉、小麦粉和硫酸镁的浓度分别为35g/L、35g/L、30g/L时发酵产量最高,确定了响应曲面的因素水平。通过响应曲面实验,研究结果显示,最适的发酵条件为黄豆饼粉32.92g/L,小麦粉36.35g/L,蛋白胨2.5g/L,麦芽浸粉2.5g/L,碳酸钙6g/L,硫酸镁30.81g/L,硫酸亚铁7.5×10-4g/L,氯化钴3.75×10-3g/L。经验证实验,该条件下发酵产量为7893.37U/mL,比优化前提高了16.72%。

全文目录

摘要  10-12
ABSTRACT  12-15
第一章文献综述  15-35
  前言  15
  1 海洋链霉菌介绍  15-19
    1.1 海洋链霉菌的特点  15
    1.2 海洋链霉菌种类及生成抗菌活性物质的国内外研究进展  15-19
  2 链霉菌菌种改良  19-27
    2.1 诱变育种  19-22
    2.2 杂交育种  22-26
    2.3 基因工程育种  26-27
  3 双亲灭活原生质体技术在链霉菌菌种改良中的应用  27
  4 本研究的目的和内容  27-29
    4.1 本文研究的目的  27
    4.2 本文研究的主要内容  27-29
  参考文献  29-35
第二章双亲灭活原生质体融合技术育种研究  35-53
  1 材料和方法  35-40
    1.1 材料  35-37
    1.2 方法  37-40
  2 结果与分析  40-49
    2.1 影响菌丝体培养的因素  40-44
      2.1.1 菌丝体培养基种类筛选  40-41
      2.1.2 蔗糖含量对菌丝生长的影响  41-42
      2.1.3 甘氨酸含量对菌丝生长的影响  42-44
    2.2 原生质体形成及再生的影响因素  44-46
      2.2.1 酶的种类  44-45
      2.2.2 酶浓度  45
      2.2.3 酶解时间  45-46
    2.3 灭活条件的研究  46-47
      2.3.1 紫外灭活条件  46
      2.3.2 热灭活条件  46-47
    2.4 原生质体的融合  47-49
      2.4.1 融合子的蹄选  47-48
      2.4.2 融合子的遗传稳定性试验  48-49
  3 讨论  49-50
  4 本章小结  50-51
  参考文献  51-53
第三章海洋链霉菌STREPTOMYCES SP.PF-1培养基优化  53-75
  1 材料与方法  53-58
    1.1 材料  53-54
    1.2 方法  54-58
  2 结果与分析  58-71
    2.1 碳源种类筛选  58
    2.2 氮源种类筛选  58-59
    2.3 无机盐种类筛选  59-60
    2.4 培养基组分单因素实验  60-63
    2.5 部分因子实验结果  63-65
    2.6 最陡爬坡实验结果  65-66
    2.7 响应面分析  66-71
  3 讨论  71-72
  4 本章小结  72-73
  参考文献  73-75
全文结论  75-77
创新点  77-79
致谢  79

利用Genome shulffling技术提高海洋链霉菌抗菌物质活性的研究

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