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拟穴青蟹（Scylla paramamosain）免疫相关基因P38、PIAS和HSP90的克隆与表达分析

作　者: 黄安明
导　师: 耿毅
学　校: 四川农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 拟穴青蟹 HSP90 P38 PIAS 克隆表达模式
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)又称青蟹,隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Syclla),是我国东南沿海地区的重要海水养殖经济蟹类之一。近年来,随着虾蟹类水产经济动物养殖的不断规模化,加之气候及环境条件的不断恶化,其病害发生也日趋严重,如弧菌病、黄水病、抖抖病、黑斑病和白斑综合征等病害已成为虾蟹养殖的严重威胁,制约着虾蟹类养殖的健康发展。对水生甲壳类动物先天免疫基因以及相关机制的研究已成为虾蟹抗病研究的热点,通过分子机制的研究,发掘虾蟹体内先天的抗病因子,研发免疫相关制剂,调控虾蟹先天免疫能力,以达到减少或清除病害,实现健康养殖的目的。本试验以拟穴青蟹为研究对象,通过对拟穴青蟹血淋巴和肝胰腺混合物转录组测序结果的比对分析筛选得到丝裂原活化蛋白激酶基因(P38)、STAT活化抑制蛋白基因(PIAS)以及热休克蛋白90(HSP90)部分cDNA序列,采用RACE技术克隆获得P38、PIAS、HSP90三个基因的cDNA全长序列,并进行了三基因编码氨基酸序列预测分析；同时采用荧光定量PCR研究了这些基因的组织分布和病原表达模式,克隆表达了拟穴青蟹HSP90基因的功能结构域,验证了HSP90蛋白的微生物结合活性。结果表明P38.PIAS和HSP90都在青蟹先天免疫系统中都发挥着重要作用,具体研究如下：1.拟穴青蟹P38和PIAS基因全长克隆及表达模式分析P38MAPK是MAPK家族中关键的成员之一,P38MAPK被认为是MAPK信号通路中的另一条经典途径,存在于脊椎动物和无脊椎动物。PIAS参与调控基因转录和细胞信号通路,在细胞的增殖、分化和凋亡,机体的免疫应答等生理病理过程中均发挥着重要的作用；同时其在P38MAPK信号通路中也起着重要的负反馈调节作用。然而,P38与PLAS基因在拟穴青蟹免疫系统中的作用及机制尚不甚明了.本研究在拟穴青蟹血细胞和肝胰腺混合物转录组测序的的基础上,分离得到这两个基因的部分序列,然后利用RACE技术首次克隆得到拟穴青蟹P38及PIAS基因cDNA全长序列,并分别命名为SpP38和SpPIAS。其中SpP38的开放读码框由1095bp碱基组成,编码一个含365个氨基酸残基的多肽,所编码蛋白的预测分子量和等电点分别为42.01KD和6.08；结构域预测分析该基因蛋白拥有一个功能结构域。组织表达分析显示SpP38在所有被检组织中均有表达,包括血细胞,心脏,肝胰腺,鳃,胃,肠,肌肉,结缔组织和性腺,其中血细胞中该基因表大量最高。经金色葡萄球菌,哈维氏弧菌及白斑综合症病毒刺激后,该基因的表达水平均被检测到有所上调。SpPIAS基因全长序列共3485bp,其中开放读码框2364bp,编码788个氨基酸,预测编码蛋白分子量和等电点分别为83.49KD和8.19。经荧光定量PCR检测,其在上述组织中均有表达,以结缔组织和性腺表达水平较高。病原刺激后的表达模式分析显示,该基因在病原刺激后同样被上调表达,以上研究结果表明这两个基因可能在无脊椎动物免疫应激反应中都发挥着重要作用。2.拟穴青蟹HSP90基因的克隆、表达分析及微生物结合活性研究HSP90是广泛存在于细胞内且高度保守的一类分子伴侣,对细胞周期、机体免疫和信号传导发挥着重要的调节作用。为进一步了解HSP90在拟穴青蟹免疫应激反应中的作用及机理。本研究在拟穴青蟹转录组测序基础上获得HSP90基因片段,经RACE技术获得其cDNA全长序列并命名为SpHSP90。该cDNA序列全长3023bp,含有一个73bp的5’UTR、2373bp的开放阅读框和577bp的3’UTR。该基因编码790个氨基酸,BLASTP显示其编码的蛋白与赤拟谷盗、蚤状溞等具有很高的同源性(98%),而与中华绒螯蟹、三疣梭子蟹、中国明对虾等甲壳动物HSP90基因所编码的氨基酸序列同源性相对较低(41%-42%)；进化分析发现SpHSP90与蚤状溞HSP90聚为一个分支。荧光定量PCR对其在血细胞、心脏、肝胰腺、鳃、胃、肠、肌肉、结缔组织和性腺中的表达分析,发现SpHSP90的转录本在肝胰腺中的表达量最高,在血细胞中的表达量最低。哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌及WSSV免疫刺激均可诱导该基因高表达,但以WSSV刺激表达量增高最显著,细菌刺激6h后该基因相对表达量出现峰值,WSSV刺激12h后相对表达量出现峰值。将该编码基因克隆到原核表达载体pET-30a进行蛋白表达,His-Tag蛋白纯化柱纯化获得目的蛋白,对HSP90蛋白的微生物(革兰氏阳性茵、革兰氏阴性菌和真菌)结合活性进行研究,结果显示SpHSP90蛋白与革兰氏阴性菌有结合活性。以上结果证明,拟穴青蟹HSP90参与机体抗细菌及病毒免疫应激反应,在先天免疫系统中发挥重要作用。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
论文缩略词表  9-14
第一部分综述：无脊椎动物病原特征及先天免疫  14-28
  1 病原特征及识别模式  15-19
    1.1 主要病原及其特征简介  15-16
      1.1.1 主要病原菌及其特征  15-16
      1.1.2 主要病毒及其特征  16
    1.2 病原相关模式分子  16-18
    1.3 病原相关模式分子的识别模式受体  18-19
  2 先天免疫系统  19-28
    2.1 物理屏障  19-20
      2.1.1 体表  19-20
      2.1.2 消化道管壁  20
    2.2 细胞免疫  20-22
      2.2.1 血细胞的吞噬和包裹作用  20-21
      2.2.2 血细胞粘连和结节形成  21-22
    2.3 体液免疫  22-28
      2.3.1 血淋巴的凝结与黑化作用  22-23
      2.3.2 抗菌肽  23
      2.3.3 体液免疫过程中的信号转导途径  23-28
第二部分拟穴青蟹(SCYLLA PARAMAMOSAIN)免疫相关基因P38、PIAS和HSP90的克隆与表达分析  28-72
  第一章拟穴青蟹P38基因和PIAS基因的克隆及表达模式分析  28-53
    1 材料和方法  29-37
      1.1 材料  29-30
        1.1.1 试剂与仪器  29
        1.1.2 病原微生物  29-30
        1.1.3 实验动物  30
      1.2 方法  30-37
        1.2.1 免疫刺激及样品采集  30
        1.2.2 总RNA提取  30-31
        1.2.3 总RNA质量检测  31
        1.2.4 第一链cDNA合成  31-32
        1.2.5 SpP38和SpPIAS全长cDNA序列克隆  32-36
        1.2.6 序列分析  36
        1.2.7 SpP38和SpPIAS表达分析  36-37
    2 结果  37-49
      2.1 总RNA质量检测  37-38
      2.2 拟穴青蟹SPP38和SPPIAS基因cDNA序列全长克隆及序列预测分析  38-41
      2.3 编码蛋白的组成与结构预测分析  41-42
      2.4 SPP38和SPPIAS基因编码氨基酸的多序列比对及进化树的构建  42-48
      2.5 拟穴青蟹HSP90基因的组织分布与病原刺激后表达模式分析  48-49
    3 讨论  49-51
    4 结论  51-53
  第二章拟穴青蟹HSP90基因的克隆、表达分析及微生物结合活性研究  53-72
    1 材料和方法  53-62
      1.1 材料  53-54
        1.1.1 试剂与仪器  53-54
        1.1.2 实验用微生物  54
        1.1.3 实验动物  54
      1.2 方法  54-62
        1.2.1 免疫刺激、样品采集、总RNA提取和第一链cDNA合成  54
        1.2.2 HSP90全长cDNA序列克隆与序列分析  54-55
        1.2.3 SpHSP90表达模式分析  55
        1.2.4 原核表达  55-59
        1.2.5 蛋白纯化  59-60
        1.2.6 Western blot验证  60-61
        1.2.7 微生物结合实验  61-62
    2 结果  62-69
      2.1 拟穴青蟹HSP90基因CDNA序列全长克隆及序列预测分析  62-64
      2.2 编码蛋白的组成与结构预测分析  64-65
      2.3 氨基酸多序列比对及进化树的构建  65-67
      2.4 拟穴青蟹HSP90基因的组织分布与病原刺激后表达模式分析  67-68
      2.5 诱导融合蛋白的表达纯化及WESTERN BLOT验证  68
      2.6 微生物结合活性  68-69
    3 讨论  69-71
    4 结论  71-72
参考文献  72-83
致谢  83-84
在读硕士期间发表论文情况  84

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