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共轭亚油酸诱导的初生小鼠下丘脑POMC启动子甲基化的研究

作　者: 张晓梅
导　师: 杨国庆
学　校: 河南农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 共轭亚油酸阿片黑皮质素原 DNA甲基化 SP1
分类号: S865.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

为了研究共轭亚油酸诱导的初生小鼠下丘脑POMC启动子的甲基化，本研究选取健康分娩时间相近的带仔昆明母鼠，随机分为两组（n=10mums,12pups/mum）；在分娩的第3天，向试验组母鼠日粮中添加1.5%的共轭亚油酸（CLA），对照组添加1.5%的亚油酸（LA），饲喂10天换成正常的饲料。在母鼠饲喂CLA/LA的第10天取母鼠乳汁对乳成分和乳脂肪酸成分进行分析。结果显示，与对照组相比，试验组母鼠乳汁中CLA含量极显著升高（P<0.01），其中一些中长链脂肪酸成分（如C10，C12，C14,C9C12C18:2,C20:2,C20:3(8，11，14)，C22:4）则显著降低（P<0.05）；乳糖和乳脂含量显著低于对照组（P<0.05，P<0.01）；但两组乳蛋白含量没有显著差异（P>0.05)，以上结果表明CLA能通过母乳传递给子代而且可以改变母乳中乳脂，乳糖和脂肪酸成分的含量。仔鼠在断奶后单笼饲养，每天检测采食量、体重，结果发现试验组仔鼠的体重显著低于对照组（P<0.05），但相对采食量显著高于对照组（P<0.05），说明泌乳期母鼠日粮添加CLA增强了断奶仔鼠的食欲。为了研究CLA改变断奶仔鼠食欲的发生机制，在体重和采食量有显著变化时腹腔麻醉取血浆和下丘脑组织。研究结果显示，试验组仔鼠在断奶后血浆胰岛素水平没有显著变化；实时荧光定量PCR检测发现，下丘脑组织中CART,NPY,AGRP,Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b和MeCP2的mRNA表达水平均没有显著变化，但POMC基因的mRNA表达水平显著降低（P<0.05），因此成为CLA增强断奶仔鼠食欲的原因之一。为了进一步研究其发生机制，我们检测了POMC基因启动子区的甲基化状态。其结果表明，试验组仔鼠下丘脑POMC基因启动子区SP1结合位点的甲基化水平升高；凝胶迁移阻滞试验结果表明POMC基因SP1结合位点的甲基化阻碍了其与SP1蛋白的结合。荧光素酶报告基因系统检测发现，POMC基因SP1位点甲基化抑制了POMC基因启动子的活性。以上结果表明POMC基因启动子SP1结合位点的甲基化抑制了其与SP1蛋白的结合，从而阻断了POMC信号通路，抑制了POMC发挥抑制食欲的作用。为了研究初生仔鼠下丘脑POMC启动子过甲基化对其成年后代谢的影响，我们对仔鼠体重做了长期检测，结果显示，CLA仔鼠在40日龄前体重较轻，随后体重逐渐超过对照组，而且在成年后血糖值显著高于对照组（P<0.05），并出现胰岛素耐受现象。这些结果表明在仔鼠成年后糖代谢出现异常。结论：母鼠泌乳期日粮添加CLA降低了乳脂、乳糖及中长链脂肪酸含量，但极显著升高乳汁中CLA含量并且造成仔鼠下丘脑POMC启动子过甲基化；初生仔鼠下丘脑POMC基因启动子SP1结合位点过甲基化阻断了POMC通路，从而影响仔鼠食欲而且影响了仔鼠成年后的糖代谢。

全文目录

致谢  4-7
摘要  7-8
文献综述  8-18
  1.1 共轭亚油酸的生理学功能及健康意义  8-11
    1.1.1 共轭亚油酸的种类，结构及来源  8-9
    1.1.2 共轭亚油酸对机体的食欲及糖代谢的影响  9-10
    1.1.3 共轭亚油酸作为添加剂在食品及畜禽产业上的应用  10-11
    1.1.4 CLA 的安全性  11
  1.2 动物食欲的调控机制  11-14
    1.2.1 下丘脑的食欲调控网络  11-12
    1.2.2 leptin 激活的 POMC 信号通路  12-14
  1.3 DNA 甲基化与重编程  14-18
    1.3.1 DNA 的甲基化  14-15
    1.3.2 DNA 甲基化与表观重编程  15-18
2 引言  18-19
3 材料与方法  19-28
  3.1 材料  19-20
    3.1.1 试验动物  19
    3.1.2 仪器  19-20
    3.1.3 试剂  20
  3.2 试验方法  20-28
    3.2.1 试验饲料的配制  20
    3.2.2 母鼠泌乳期奶样的制备及母鼠乳营养成分和乳脂肪酸成分的检测  20-21
    3.2.3 试验仔鼠采食量、体重以及成年后血糖水平、胰岛素耐受  21
    3.2.4 CLA 仔鼠断奶后食欲的检测  21-22
    3.2.5 Quantitative RT-PCR 对断奶仔鼠食欲相关基因表达的检测  22-23
    3.2.6 下丘脑 POMC 基因启动子 CpG 位点甲基化状态的检测  23-26
    3.2.7 荧光素酶报告基因系统对-100 处甲基化的 POMC 启动子活性的检测  26-27
    3.2.8 数据处理  27-28
4 结果与分析  28-38
  4.1 CLA 对母鼠乳成分的影响  28
  4.2 CLA 对母乳脂肪酸成分的影响  28
  4.3 CLA 对母鼠乳液中 leptin 的影响  28
  4.4 CLA 对断奶仔鼠采食量和体重的影响  28
  4.5 CLA 对断奶仔鼠血浆 leptin 的影响  28-29
  4.6 CLA 对断奶仔鼠食欲相关基因表达的影响  29
  4.7 CLA 对 POMC 基因启动子甲基化的影响  29-30
  4.8 CLA 对断奶仔鼠甲基转移酶和 MeCP2 基因表达的影响  30
  4.9 POMC 基因启动子-100 CpG 位点的甲基化对其启动子活性的影响  30
  4.10 POMC 基因 SP1 结合位点甲基化对 DNA 蛋白互作的影响  30
  4.11 CLA 对断奶仔鼠体重和采食量的长期影响  30-33
  4.12 CLA 对断奶仔鼠成年后血糖水平的影响  33
  4.13 CLA 对断奶仔鼠成年后胰岛素耐受的影响  33-38
5 讨论与结论  38-42
  5.1 讨论  38-41
  5.2 结论  41-42
参考文献  42-49
英文摘要  49-50

共轭亚油酸诱导的初生小鼠下丘脑POMC启动子甲基化的研究

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