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小鼠Musclin真核表达载体的构建及孕激素对Musclin,Smad3和MEF2基因表达的调控

作 者: 周英
导 师: 杜荣
学 校: 山西农业大学
专 业: 基础兽医学
关键词: Musclin 孕激素 骨骼肌 Smad3 MEF2
分类号: S865.13
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


Musclin基因是一种近期发现的骨骼肌来源的活性多肽。在骨骼肌中,Musclin基因的表达水平受肌肉类型、营养状况、激素及细胞因子等多种因素的调节。Musclin通过自分泌和旁分泌的作用,参与机体的葡萄糖代谢和脂肪代谢,可能与糖尿病或胰岛素抵抗性疾病密切相关。因此,深入研究Musclin的生物学功能和表达调控具有重要的意义。本研究根据NCBI上登录的小鼠Musclin基因序列(NM198112.2)设计引物,利用PCR技术,扩增了小鼠骨骼肌中Musclin CDS区的序列,并连接到T载体。测序正确后,进一步构建了小鼠pcDNA3.1(+)-Musclin真核表达载体,为深入研究Musclin的生物学功能和作用机制奠定了基础。另外,本试验选用24只雌性小鼠,初始体重约为20g左右,随机分为四组:对照组(注射生理盐水)、低浓度孕激素组(2mg/kg体重)、中浓度孕激素组(4mg/kg体重)、高浓度孕激素组(8mg/kg体重)。每只小鼠注射剂量为0.1mL,每日肌肉注射1次。连续注射一周后采样。检测骨骼肌中Musclin mRNA和蛋白表达量变化,以及肌肉相关基因Smad3MEF2A、MEF2C、MEF2DmRNA的表达水平,结果表明:(1)注射不同剂量孕激素小鼠的体重均比对照组的小鼠体重有所增加。(2)实时荧光定量PCR结果显示:低剂量和高剂量孕激素分别下调Musclin基因mRNA的表达,而中剂量孕激素则显著上调其表达;Western blotting结果显示:低剂量和高剂量孕激素组小鼠骨骼肌中Musclin的蛋白表达量稍低于对照组,而中剂量孕激素组则显著高于对照组。(3)实时荧光定量PCR结果显示:各浓度孕激素对Smad3基因表达产生上调作用,其中高剂量作用显著;各浓度孕激素都能下调MEF2A基因的表达,其中中剂量和高剂量作用显著;中剂量和高剂量孕激素都能下调MEF2C基因的表达,其中中剂量作用显著;中剂量和高剂量孕激素都能下调MEF2D基因的表达,其中高剂量作用显著。综上所述,不同剂量孕激素能上调或下调Musclin及其它肌肉相关基因(Smad3、 MEF2A、MEF2C、MEF2D)的表达,且Musclin基因表达与Smad3、MEF2基因表达有一定的相关性。本研究为Musclin的生物学功能和表达调控提供了一定的理论依据,为以后深入研究Musclin的作用机制奠定了理论基础。

全文目录


摘要  7-8
前言  8-9
文献综述  9-19
  1 Musclin基因的研究进展  9-10
    1.1 Musclin的发现与结构  9
    1.2 Musclin的分布  9-10
    1.3 Musclin的生物学功能  10
  2 Smad3的研究进展  10-12
    2.1 Smad3的发现与结构  10-11
    2.2 Smad3的信号通路及功能  11-12
  3 MEF2基因的研究进展  12-15
    3.1 MEF2基因的发现及结构  12-13
    3.2 MEF2基因的分布  13
    3.3 MEF2基因的几种信号通路及生物学功能  13-15
  4 孕激素与肌肉生长发育  15-18
    4.1 孕激素概述  15
    4.2 孕激素受体PR的结构  15-16
    4.3 孕激素的作用机制  16-17
    4.4 孕激素对肌肉生长发育的影响  17-18
  本研究的立项依据和研究意义  18-19
试验一 小鼠Musclin cDNA的克隆及其真核表达载体的构建  19-31
  1 材料和方法  19-20
    1.1 试验动物、菌株和质粒载体  19
    1.2 主要试剂  19
    1.3 主要试剂的配制  19-20
    1.4 主要仪器及设备  20
  2 试验方法  20-25
    2.1 小鼠Musclin cDNA的扩增及克隆  20-22
    2.2 小鼠pcDNA3.1(+)-Musclin真核表达载体的构建  22-25
  3 结果与分析  25-29
    3.1 小鼠骨骼肌RNA的提取  25
    3.2 RT-PCR扩增小鼠骨骼肌中Musclin基因序列  25-26
    3.3 小鼠骨骼肌中Musclin cDNA序列的T-A克隆及鉴定  26-28
    3.4 pcDNA3.1(+)-Musclin真核表达载体的构建和酶切测序的鉴定  28-29
  4 讨论  29-31
    4.1 小鼠骨骼肌总RNA提取的注意事项  29-30
    4.2 关于PCR反应条件  30
    4.3 构建载体时双酶切位点的选择  30-31
试验二 孕激素对小鼠Musclin及其它肌肉相关基因表达的调控  31-53
  1 材料和方法  31-33
    1.1 试验动物和激素  31
    1.2 主要试剂  31
    1.3 主要试剂及溶液的配制  31-33
    1.4 主要仪器及设备  33
  2 试验方法  33-38
    2.1 试验动物的分组及孕激素注射  33
    2.2 小鼠骨骼肌RNA的提取及反转录合成cDNA  33
    2.3 实时荧光定量PCR反应  33-35
    2.4 Western blotting  35-38
  3 结果与分析  38-50
    3.1 试验动物体重变化  38
    3.2 Musclin荧光定量PCR和Western Blotting结果  38-42
    3.3 Smad3和MEF2(A、C、D)基因荧光定量PCR结果  42-49
    3.4 Musclin与Smad3、MEF2基因表达的相关性  49-50
  4 讨论  50-53
    4.1 关于实时荧光定量PCR反应  50
    4.2 免疫印迹条件的优化  50
    4.3 孕激素对Musclin基因表达的调控  50-51
    4.4 孕激素对Smad3和MEF2基因表达的调控  51-52
    4.5 Musclin基因表达与Smad3、MEF2基因表达之间的相关性  52-53
结论  53-54
参考文献  54-60
Abstract  60-62
附录  62-66
致谢  66

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 狩猎、野生动物驯养 > 各种野生动物驯养 > 实验用动物 > 小白鼠
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