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小鹅瘟单克隆抗体的制备及其鉴定
作 者: 崔明超
导 师: 柴同杰
学 校: 山东农业大学
专 业: 兽医
关键词: GPV 扩增克隆和鉴定 杂交瘤细胞 单克隆抗体 ELISA
分类号: S858.33
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
下 载: 4次
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内容摘要
小鹅瘟(Gosling Plague, GP)又称鹅细小病毒病,最早的时候是由我国教授方定一于1956年发现并用鹅胚分离到小鹅瘟病毒(Goose Parvovirus, GPV)。此病主要是导致30日龄内的雏鹅与雏番鸭感染发病,雏鹅在10日龄的发病和死亡率能达到100%,此病是一种传播速度极快和死亡率很高的烈性传染病。小鹅瘟的诊断是目前学者们普遍关注的问题,并且这一问题直接关系养鹅业的发展。本试验纯化了GPV病毒并且对目的基因片段VP3进行了扩增、克隆和鉴定,同时将所得序列与已发表GPV的VP3序列的同源性进行了比较,结果同源性在95.8%-99.5%之间,说明所克隆片段是所需要的目的片段。本试验继续用纯化的GPV病毒当做抗原对BALB/C小鼠进行免疫并借此建立出间接ELISA方法用来对阳性杂交瘤细胞株进行筛选,在经过反复的试验后确定了用来进行间接ELISA筛选方法的最佳反应条件,即用纯化的GPV当做抗原以1:1600稀释,包被过夜在4℃,阴阳性对照分别采用1:200稀释阴、阳性血清,以37℃1h为反应条件最好,酶标二抗以1:2000作为工作浓度稀释。取免疫BALB/C小鼠的脾脏与培养的骨髓瘤细胞做融合,用建立成功的间接ELISA方法对融合成功的杂交瘤细胞进行筛选检测,经过初检、二检和三检共获得6株阳性杂交瘤的细胞株,又用有限稀释法对阳性细胞株进行了3-4次的亚克隆(其中最少两次是单克隆)后获得了2株能稳定的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将其分别命名为5F11、3C11。对这2株杂交瘤细胞株的腹水效价、亚类、染色体数、特异性和稳定性进行了鉴定,结果如下:经过连续传代20余次和冻存后120天复苏检测,细胞株分泌McAB差异不显著,稳定性很好;染色体数均介于100~110之间,具有典型杂交瘤细胞的染色体特征;经单克隆抗体亚型鉴定,5F11、3C11杂交瘤分泌的抗体类型均为IgG1;单抗腹水效价分别为分别为1:819200,1:1638400;并具有很好的特异性。
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全文目录
中文摘要 8-9 Abstract 9-10 1 引言 10-23 1.1 小鹅瘟(GPV)概述 10-16 1.1.1 病毒分类 10 1.1.2 病毒结构特征 10-11 1.1.3 GPV的分类新地位 11-12 1.1.4 GPV形态、理化特性和抵抗力 12 1.1.5 GPV的血凝特性 12 1.1.6 GPV的血清型 12 1.1.7 GPV的宿主和培养 12-13 1.1.8 流行病学 13 1.1.9 临床症状 13-14 1.1.10 病理变化 14 1.1.11 防制 14-16 1.2 小鹅瘟的免疫及治疗 16 1.2.1 小鹅瘟的疫苗免疫 16 1.2.2 小鹅瘟特异性治疗 16 1.3 小鹅瘟实验室诊断技术 16-20 1.3.1 病毒的分离鉴定 16-17 1.3.2 血清学方法 17-19 1.3.2.1 琼脂扩散试验(APG) 17 1.3.2.2 对流免疫电泳法 17 1.3.2.3 精子凝集试验 17-18 1.3.2.4 反向间接血凝试验 18 1.3.2.5 病毒中和试验(VN) 18 1.3.2.6 免疫荧光诊断法 18-19 1.3.2.7 酶联免疫吸附试验(ELISA) 19 1.3.3 分子生物学方法 19-20 1.3.3.1 聚合酶链式反应(PCR) 19 1.3.3.2 核酸探针法 19-20 1.4 单克隆抗体研究进展 20-21 1.5 本研究的目的及意义 21-23 2 材料与方法 23-39 2.1 材料 23-26 2.1.1 菌株 23 2.1.2 实验动物及细胞株 23 2.1.3 酶和相关试剂 23 2.1.4 主要仪器 23 2.1.5 溶液系统 23-26 2.2 方法 26-39 2.2.1 GPV的增殖与纯化 26 2.2.1.1 GPV的增殖 26 2.2.1.2 GPV的纯化 26 2.2.2 GPV的分子鉴定 26-30 2.2.2.1 GPV总DNA提取 26-27 2.2.2.2 GPV目的片段的扩增 27 2.2.2.3 电泳检测 27 2.2.2.4 目的核苷酸克隆测序 27-30 2.2.3 小鹅瘟单克隆抗体的制备及鉴定 30-39 2.2.3.1 Balb/c小鼠的免疫 30-31 2.2.3.2 单抗制备筛选方法的建立 31-34 2.2.3.3 SP2/0骨髓瘤细胞的培养 34 2.2.3.4 饲养细胞的制备 34 2.2.3.5 细胞融合及培养 34-35 2.2.3.6 筛选 35 2.2.3.7 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 35-36 2.2.3.8 杂交瘤细胞的冻存与复苏 36 2.2.3.9 腹水的制备 36 2.2.3.10 单克隆抗体的鉴定 36-37 2.2.3.11 单克隆抗体的纯化 37-39 3 结果与分析 39-43 3.1 鹅胚增殖GPV后结果 39 3.2 GPV纯化结果 39 3.3 目的基因片段VP3扩增、克隆及鉴定 39-40 3.4 间接ELISA检测方法的建立 40-41 3.5 Balb/c小鼠的免疫及SP2/0骨髓瘤细胞的培养结果 41 3.6 融合筛选结果 41 3.7 阳性杂交瘤细胞的亚克隆结果 41 3.8 单克隆抗体鉴定结果 41-43 3.8.1 杂交瘤细胞的稳定性 41-42 3.8.2 杂交瘤细胞染色体计数结果 42 3.8.3 腹水的效价 42 3.8.4 单克隆抗体特异性鉴定 42 3.8.5 单克隆抗体亚型的鉴定 42-43 3.9 单抗的纯化与鉴定 43 3.9.1 蛋白浓度的测定 43 3.9.2 单抗效价的测定 43 4 讨论 43-46 4.1 小鼠的免疫 43-44 4.2 建立筛选方法 44 4.3 细胞融合 44-45 4.4 阳性克隆的筛选 45-46 4.5 腹水的制备 46 4.6 单克隆抗体的纯化 46 5 结论 46-47 6 参考文献 47-53
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鹅
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