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鸭坦布苏病毒病发病模型的建立及免疫抗体持续期的测定

作 者: 周晓波
导 师: 李银
学 校: 南京农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词:  坦布苏病毒 攻毒量 抗体保护临界值 免疫持续期
分类号: S858.32
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


2010年4月以来,江苏、浙江、福建、安徽、江西和河北等省的发生了一种以产蛋率、采食量显著下降,具有脑炎样神经症状的传染病,研究表明引起该病的病原为不同于现有资料报道的一种新的黄病毒,即坦布苏病毒。该病毒感染率高达100%,发病率和死亡率在5%~30%之间,产蛋率下降40%~50%,给鸭鹅养殖业造成巨大的经济损失。为了研究该病发病机理,本试验建立了其发病模型;为了更好地防控该疫病的爆发,还进行了攻毒保护性试验和免疫抗体持续期监测。将168只35日龄无坦布苏病毒感染的樱桃谷肉鸭随机分成7组,每组24只,其中1~6组分别以不同含量的鹅源坦布苏JS804株病毒肌肉注射进行攻毒,对照组肌肉注射相同剂量的PBS。攻毒后每天观察临床症状。分别于攻毒后2d、4d、6d、8d、13d、20d每组随机取4只攻毒鸭扑杀,分别取每只鸭各脏器样品2份,一份放-20℃冻存,用于多重RT-PCR检测病毒;另一份用4%多聚甲醛固定,用于免疫组织化学分析和组织病理学分析。临床症状观察:试验鸭于攻毒后腿瘫、头颈扭曲、行走不稳。剖检变化:各主要脏器均出现病变,其中以脾脏、肝脏、脑最为明显。套氏RT-PCR结果:攻毒后第8天各脏器病毒阳性检出率最高,其中以脾脏检出率最高;通过对不同攻毒量各组的检测,确定鸭的攻毒量为1.6×106TCID50。HE染色病理切片观察:脑神经元细胞变性、坏死;肝细胞水泡变性、肝小叶结构破坏;脾脏淋巴细胞变性、坏死,红、白髓界限不清。免疫组化定位发现:心肌纤维细胞、脾脏生发中心、肺泡上皮细胞、肾小球上皮细胞、脑血管内皮细胞、肝细胞均有棕黄色阳性信号。将50只14日龄无坦布苏病毒感染的樱桃谷肉鸭随机平分成5组,每组10只,其中1~4组分别以不同抗原含量的坦布苏病毒病灭活疫苗肌肉注射进行免疫,对照组肌肉注射相同剂量的PBS。免疫后21天采血,测定每一只鸭的抗体水平,用第二章已确定攻毒量(1.6×106TCID50)的鹅源坦布苏JS804株病毒进行攻毒,攻毒后8天扑杀所有试验鸭,多重RT-PCR检测鸭脾脏中有无坦布苏病毒。结果:当抗体效价是29时,攻毒保护率达88.9%,鸭坦布苏病毒抗体保护临界值为29;同时确定了灭活疫苗最小免疫量是3.8×105TCID50。30只23日龄无坦布苏病毒感染的樱桃谷肉鸭随机均分成3组(单次免疫组、两次免疫组、对照组),免疫后定期采血测定抗体效价。结果表明两次免疫效果较单次免疫好。20只23日龄无坦布苏病毒感染的樱桃谷肉鸭随机均分成1、2组(免疫组和对照组),20只54日龄无坦布苏病毒感染的樱桃谷肉鸭随机均分成3、4组(免疫组和对照组),免疫后定期测定抗体效价,监测维持期。发现抗体效价半年能维持在较高的水平,且两种日龄首免鸭无明显差异。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
英文缩略表  11-13
第一篇 文献综述  13-35
  第一章 坦布苏病毒的研究进展  13-35
    1 引言  13-14
    2 病原学  14-15
      2.1 基因结构  14-15
      2.2 理化特征与培养特性  15
    3 流行病学  15-17
    4 临床症状与病理变化  17-19
      4.1 临床症状  17-18
      4.2 病理变化  18-19
    5 实验室诊断方法  19-23
      5.1 病原检测  19-20
      5.2 免疫组化方法  20-21
      5.3 间接免疫荧光试验  21-22
      5.4 酶联免疫吸附试验  22
      5.5 蚀斑减少中和试验  22
      5.6 分子生物学检测  22-23
    6 疫苗相关的研究  23-26
      6.1 灭活疫苗  23
      6.2 减毒活疫苗  23-24
      6.3 DNA疫苗  24-25
      6.4 亚单位疫苗  25
      6.5 嵌合疫苗  25-26
    7 实验动物模型相关研究  26-27
    8 研究目的和意义  27-28
    参考文献  28-35
第二篇 试验研究  35-115
  第二章 鸭坦布苏病毒病发病模型的建立  35-97
    摘要  35
    1 材料  35-36
      1.1 毒株与实验动物  35
      1.2 主要试剂  35-36
      1.3 主要仪器设备  36
    2 方法  36-41
      2.1 病毒的增殖与TCID_(50)的测定  36
      2.2 试验动物分组与攻毒  36-37
      2.3 临床症状及剖检病变的观察  37
      2.4 多重RT-PCR检测  37-39
      2.5 主要脏器组织病理学变化  39-40
      2.6 主要脏器免疫组织化学(IHC)分析  40-41
    3 结果  41-91
      3.1 病毒的滴度  41
      3.2 临床症状及剖检变化  41-44
      3.3 多重RT-PCR检测  44-84
      3.4 病理组织学变化  84-88
      3.5 免疫组织化学分析  88-91
    4 讨论  91-95
      4.1 试验动物及日龄的选择  91
      4.2 接种途径、剂量及毒株的选择  91
      4.3 免疫组织化学分析  91-92
      4.4 鸭坦布苏病毒病发病模型的建立  92-95
    参考文献  95-96
    ABSTRACT  96-97
  第三章 疫苗免疫保护效果的评价  97-107
    摘要  97
    1 材料  97-98
      1.1 疫苗、毒株与实验动物  97
      1.2 主要试剂  97
      1.3 主要仪器设备  97-98
    2 方法  98-100
      2.1 病毒增殖与TCID_(50)的测定  98
      2.2 包被抗原的制备  98
      2.3 间接ELISA检测抗体滴度操作方法与结果判定  98-99
      2.4 实验动物分组与免疫  99
      2.5 采血与攻毒  99
      2.6 临床观察与剖检变化  99
      2.7 套氏RT-PCR检测  99-100
      2.8 数据处理  100
    3 结果  100-102
      3.1 临床观察及剖检变化  100
      3.2 抗体效价的测定  100-101
      3.3 免疫保护效果分析  101-102
    4 讨论  102-104
    参考文献  104-105
    ABSTRACT  105-107
  第四章 抗体持续期的测定  107-115
    摘要  107
    1 材料  107-108
      1.1 疫苗与实验动物  107
      1.2 主要试剂  107
      1.3 主要仪器设备  107-108
    2 方法  108
      2.1 免疫程序试验  108
      2.2 抗体持续期试验  108
    3 结果  108-110
      3.1 免疫程序  108-109
      3.2 抗体持续期  109-110
    4 讨论  110-113
      4.1 免疫程序的选择  111-112
      4.2 抗体持续期的监测  112-113
    参考文献  113-114
    ABSTRACT  114-115
全文总结  115-117
附录  117-121
致谢  121

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 >
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