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鸭坦布苏病毒JS2010株的分离鉴定及间接ELISA检测方法的建立

作　者: 靳宇田
导　师: 张小飞
学　校: 安徽农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭坦布苏病毒分离鉴定全基因组测定 E蛋白表达间接ELISA方法
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

2010年春季，在我国中东部养鸭较密集地区的鸭群中发生了一种以蛋鸭采食量减少、共济失调和产蛋量急剧下降甚至停产或死亡为主要特征的传染病。该病传播迅速，很快蔓延至上海、安徽、江苏、山东、河北等全国大部分养鸭地区，给我国养鸭业造成了严重的经济损失。确定该病的病原，建立其快速诊断方法具有重要意义。首先，对江苏某种鸭场临床发病鸭进行病原分离和鉴定。取典型症状病鸭的组织脏器匀浆过滤液尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚，4～6天后鸡胚死亡，剖检可见胚体水肿、充血，绒毛尿囊膜水肿增厚，脾脏、肾脏肿大，肝脏发黄，表面有坏死灶。收集鸡胚毒，命名为JS2010分离株。对分离毒株进行血凝性、培养特性、致病性和PCR检测，发现该毒株对鸡、鸭、鹅和猪的红细胞无凝集作用；病毒接种鸡胚成纤维细胞（CEF）和非洲绿猴肾细胞（Vero）后不造成细胞病变，RT-PCR检测病毒核酸呈阴性，但可以在乳仓鼠肾细胞（BHK-21）中增殖并产生细胞病变；对鸡胚的半数致死量和对BHK-21细胞的半数感染量分别为103.68ELD50/0.2mL和105.33TCID50/0.2mL，病毒感染后病鸭的组织病理变化主要表现在肝细胞脂肪变性，肝小叶之间淋巴细胞增生，空肠固有层细胞结构破坏严重，固有膜淋巴细胞浸润，部分上皮脱落，大肠严重出血，肠腔内充满大量血细胞，肠壁出血点明显；以鸭坦布苏病毒特异性引物从鸡胚毒中PCR扩增出862bp目的基因片段，测序结果显示与鸭坦布苏病毒BYD-1株的同源性高达99%。综合分析鉴定结果，确定该分离毒株为鸭坦布苏病毒（DuckTembusuvirus，DTMUV）。其次，对DTMUV-JS2010株进行全基因组测序分析。根据GenBank中登录的DTMUVBYD-1株（JF312912）全基因组序列设计11对特异性引物，通过RT-PCR方法对JS2010株的全基因进行分段克隆并测序。结果显示，该毒株全基因序列核苷酸为10990nt，包含一个大小为10278nt的完整的开放阅读框。序列分析表明，JS2010株与DTMUV参考毒株的全基因组核苷酸同源性为99.2%～99.6%。针对囊膜蛋白E基因进行序列比对和系统进化树分析显示，JS2010株与黄病毒属Ntaya病毒群的Tembusu病毒的核苷酸同源性为87.7%～99.5%，与JS804株处于同一进化分支上，表明JS2010株为黄病毒属Ntaya病毒群的Tembusu病毒。然后，克隆表达JS2010株囊膜蛋白E基因，制备重组E蛋白，为建立间接ELISA方法提供试验材料。应用基因重组技术构建重组表达质粒pET-32a-E，转化至E.coliRosetta进行大量诱导表达，进而使用Ni-NTA亲合层析柱纯化重组蛋白E。经SDS-PAGE和Western-blot分析，发现制备的重组蛋白浓度为0.58mg/mL，纯度达到95%，保留天然蛋白的抗原性，满足免疫检测试剂的要求。最后，建立基于重组E蛋白的间接ELISA方法并进行临床应用。以纯化的重组E蛋白为包被抗原，优化ELISA检测方法的试验条件，确定抗原最佳包被浓度为2.9ug/mL，血清和酶标抗体最佳稀释度分别为1:200和1:5000，阴阳性临界值判定标准为0.361，从而建立了检测DTMUV抗体的间接ELISA方法。特异性、灵敏性和重复稳定性试验的结果显示该方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。应用建立的间接ELISA方法对江苏、山东、安徽等地临床采集的鸡、鸭血清进行抗体检测，鸡血清阳性检出率24.42%（21/86），鸭血清阳性检出率32.64%（63/193）。结果表明，建立的间接ELISA诊断方法可用于鸭坦布苏病毒临床样品的抗体检测。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
图表目录  10-11
常用中英文缩略词  11-12
文献综述  12-20
引言  20-22
1 材料与方法  22-33
  1.1 实验菌株、质粒和血清  22
  1.2 酶类与主要试剂（盒）11  22
  1.3 实验用SPF鸡胚和细胞系  22
  1.4 主要培养基与溶液的配制  22-25
    1.4.1 主要培养基的配制  22-23
    1.4.2 细胞培养所用溶液  23
    1.4.3 感受态细胞制备及转化用溶液  23
    1.4.4 SDS-PAGE电泳所需溶液  23-24
    1.4.5 蛋白表达及提纯所用溶液  24-25
    1.4.6 Western-blot及ELISA所用溶液  25
  1.5 主要仪器  25-26
  1.6 鸭坦布苏病毒的分离  26
    1.6.1 病料采集  26
    1.6.2 病毒分离  26
  1.7 鸭坦布苏病毒的鉴定  26-27
    1.7.1 血凝性测定  26
    1.7.2 PCR鉴定  26-27
  1.8 病毒分离株JS2010的培养特性与致病性研究  27-28
    1.8.1 病毒的鸡胚培养  27
    1.8.2 病毒的细胞培养  27-28
    1.8.3 鸡胚半数致死量(ELD50)的测定  28
    1.8.4 病毒半数细胞感染量(TCID50)的测定  28
    1.8.5 病毒感染后组织病理变化检查  28
  1.9 病毒分离株JS2010的全基因组测序与分析  28-29
    1.9.1 引物设计  28-29
    1.9.2 PCR扩增  29
    1.9.3 全基因组序列的分析  29
  1.10 鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达与纯化  29-31
    1.10.1 E蛋白基因的PCR扩增  29-30
    1.10.2 目的基因与表达质粒的连接  30
    1.10.3 连接产物的转化与鉴定  30
    1.10.4 重组E蛋白的表达与分析  30-31
    1.10.5 重组E蛋白的纯化  31
    1.10.6 重组E蛋白浓度的测定  31
  1.11 DTMUV的间接ELISA检测方法建立  31-33
    1.11.1 包被抗原和抗体的最佳稀释倍数确定  31
    1.11.2 一抗和酶标二抗最佳孵育时间的确定  31
    1.11.3 间接ELISA判定标准的确定  31-32
    1.11.4 间接ELISA方法的特异性测定  32
    1.11.5 间接ELISA方法的敏感性测定  32
    1.11.6 间接ELISA方法的重复性测定  32
    1.11.7 间接ELISA方法检测临床样品  32-33
2 结果与分析  33-44
  2.1 病毒的分离结果  33
  2.2 病毒的鉴定  33-34
  2.3 病毒培养特性与致病性  34-36
    2.3.1 培养特性  34-35
    2.3.2 病毒的鸡胚半数致死量（ELD50）24  35
    2.3.3 病毒的细胞半数感染量（TCID50）24  35-36
    2.3.4 组织病理变化  36
  2.4 DTMUV-JS2010分离株的全基因组测序与分析  36-39
    2.4.1 各基因片段的扩增与序列测定  36-37
    2.4.2 全基因组序列分析  37-39
  2.5 重组pET-32a-E质粒的构建与鉴定  39-40
  2.6 E蛋白的表达与纯化  40-41
  2.7 间接ELISA方法的建立  41-44
    2.7.1 包被抗原和抗体的最佳稀释倍数  41
    2.7.2 一抗和酶标抗体的最佳作用时间  41-42
    2.7.3 间接ELISA方法的特异性  42
    2.7.4 间接ELISA方法的敏感性  42
    2.7.5 间接ELISA方法的重复性  42-43
    2.7.6 临床样品的检测结果  43-44
3 讨论  44-47
  3.1 鸭坦布苏病毒的培养特性与致病性  44
  3.2 鸭坦布苏病毒的全基因组序列分析  44-45
  3.3 重组E蛋白的制备  45
  3.4 间接ELISA检测方法的建立及分析  45-47
结论  47-48
参考文献  48-52
附录  52-54
致谢  54-55
作者简介  55

鸭坦布苏病毒JS2010株的分离鉴定及间接ELISA检测方法的建立

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