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鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
作 者: 林源
导 师: 刘毅
学 校: 湖南农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 鸭坦布苏病毒 E蛋白 单克隆抗体 鉴定
分类号: S858.32
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是一种可引起鸭产蛋量和采食量严重下降为主要特征的新发病毒。DTMUV属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)的蚊媒病毒类病毒,并且与色列火鸡脑膜脑炎病毒(Israel turkey meningoencephalitis virus)、巴格扎病毒(Bagaza virus)和恩塔亚病毒(Ntaya virus)同属恩塔亚病毒血清群。该病从2010年春天开始导致中国大部分养鸭业遭受巨大的经济损失。黄病毒科病毒大多为传染性的人畜共患病病原,也曾有报道在人体内发现抗坦布苏病毒抗体,这些都表明鸭坦布苏病毒对公共卫生安全有潜在的威胁。因此,继续对坦布苏病毒进行深入系统的研究,建立高效可靠的检测方法,做好充分的技术储备是极其必要的。DTMUV有三种主要的结构蛋白,分别为核衣壳蛋白(C)、膜蛋白(prM/M)和包膜蛋白(E)。其中,鸭黄病毒E蛋白作为病毒粒子中免疫原性最强的结构蛋白之一,对于鸭坦布苏病毒病的诊断及监控防治具有重要意义。本研究用本实验室保存的含DTMUV-E基因的重组质粒pET30a-E转化Rosetta(DE3)感受态细胞,在终浓度为0.5mmol/L的IPTG中,37℃振摇诱导表达E蛋白。裂解菌体后进行SDS-PAGE电泳结果显示重组E蛋白在原核表达系统中表达量较大,其相对分子质量约为55ku,以可溶性形式存在。用6X His Spin Purification kit纯化表达的E蛋白并定量。以原核表达的重组E蛋白为免疫原,免疫4-6周龄BALB/c鼠,三次免疫并加强免疫后通过常规杂交瘤技术将小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。以原核表达并纯化出的E蛋白为检测用抗原包被ELISA板,建立间接ELISA检测方法筛选分泌E蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。对ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞及时采用有限稀释法进行3-5次亚克隆培养,获得1株稳定分泌抗DTMUVE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,并命名为LY12。Western blot和IFA分析表明,所获得细胞分泌的抗体只与DTMUV的E蛋白发生特异性反应,与JEV和WNV无交叉反应。进一步鉴定该单抗的抗体亚类为IgGl,轻链为κ链。本研究为建立鉴别诊断鸭黄病毒灵敏性较高ELISA方法,为鸭黄病毒的相关基础研究,监测及诊断提供基础。
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全文目录
摘要 4-5 Abstract 5-9 第一章 绪论 9-16 1 鸭坦布苏病毒概述 9-12 1.1 病原学 9-10 1.2 基因组结构和特征 10 1.3 流行病学 10-11 1.4 临床症状和病理变化 11 1.5 鸭坦布苏病毒的检测 11-12 2 基因组编码蛋白的生物学功能 12-14 2.1 C蛋白 12 2.2 prM/M蛋白 12-13 2.3 E蛋白 13 2.4 NS1蛋白 13 2.5 NS2A、NS2B、NS4A和NS4B蛋白 13-14 2.6 NS3蛋白 14 2.7 NS5蛋白 14 3 本研究的的目的与意义 14-16 第二章 鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达、纯化及鉴定 16-21 1 实验材料 16-17 1.1 基因、菌株、质粒和细胞 16 1.2 主要试剂 16 1.3 主要溶液和培养基的配制 16-17 1.4 主要仪器设备 17 2 实验方法 17-19 2.1 E基因的原核表达 17-18 2.2 原核表达重组E蛋白的纯化 18 2.3 纯化后蛋白的定量 18-19 3 实验结果 19-20 3.1 表达产物的SDS-PAGE电泳分析 19 3.2 表达产物的纯化 19-20 3.3 蛋白的定量 20 4 讨论 20-21 第三章 鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 21-35 1 实验材料 21-23 1.1 病毒、细胞株、血清以质粒 21 1.2 主要试剂 21 1.3 主要溶液的配制 21-22 1.4 主要仪器设备 22-23 2 实验方法 23-29 2.1 动物免疫 23 2.2 小鼠的骨髓瘤细胞的培养 23 2.3 饲养细胞的制备 23-24 2.4 细胞融合 24-25 2.5 间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞 25-26 2.6 克隆、扩大培养和冻存 26 2.7 腹水的制备、纯化及浓度测定 26-27 2.8 单克隆抗体的鉴定 27-29 3 实验结果 29-32 3.1 细胞融合率和阳性率 29-30 3.2 腹水的浓度测定 30 3.3 Western blot鉴定 30-31 3.4 间接免疫荧光分析 31 3.5 抗体亚型的鉴定 31-32 3.6 杂交瘤细胞稳定性检测 32 4 讨论 32-35 4.1 动物免疫 32-33 4.2 细胞融合 33 4.3 阳性杂交瘤细胞株的筛选 33 4.4 单克隆抗体的应用价值 33-35 第四章 全文结论 35-36 参考文献 36-44 英文缩略表 44-45 致谢 45-46 作者简介 46
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸭
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